Текущий†Адрес: OX11 0DE, Великобритания, Diamond Building, Harwell Science and Innovation Park, Dietcote, Oxfordshire, Великобритания, Diamond Light Source Co., Ltd., Electronic Biological Imaging Center.
Реакционный центр светособирающего комплекса 1 (RC-LH1) является основным фотосинтетическим компонентом пурпурных фототрофных бактерий. Мы представили две структуры комплекса RC-LH1 из Rhodopseudomonas palustris, полученные методом криоэлектронной микроскопии. Структура комплекса RC-LH114-W с разрешением 2,65 Å состоит из 14 петель LH1, окружающих реакционный центр, которые прерываются белком W, в то время как комплекс без белка W полностью состоит из реакционного центра, окруженного замкнутой петлей LH1 из 16 субъединиц. Сравнение этих структур позволяет получить представление о динамике хинона в комплексе RC-LH1, включая ранее не определенные конформационные изменения при связывании хинона в сайте QB реакционного центра, а также о расположении вспомогательных сайтов связывания хинона, которые помогают передавать его реакционному центру. Уникальная структура белка W предотвращает замыкание петли LH1, создавая тем самым канал для ускорения обмена хинона/хинолона.
Энергия, получаемая в результате фотосинтеза, может поддерживать почти всю жизнь на Земле и обладает огромным потенциалом для солнечной биотехнологии. Помимо глобального фотосинтеза, пурпурные фототрофные бактерии также демонстрируют различные энергетические режимы и метаболические возможности. Они могут избегать фотосинтеза и расти как гетеротрофные бактерии в темноте, могут фиксировать азот и углекислый газ, производить водород и разлагать ароматические соединения (1-3). Для обеспечения энергией этих процессов свет должен быстро и эффективно преобразовываться в химическую энергию. Этот процесс начинается, когда светоулавливающий антенный комплекс поглощает свет и передает захваченную энергию реакционному центру (РЦ), тем самым начиная разделение зарядов (4-7). Основная единица фотосинтеза у пурпурных фототрофных бактерий состоит из РЦ типа 2, окруженного светособирающим комплексом 1 (LH1), образующим ядро ​​комплекса РЦ-LH1. LH1 образован массивом изогнутых αβ-гетеродимеров, каждый из которых связывает две молекулы бактериального хлорофилла (BChl) a и один или два каротиноида (8-12). Простейшая антенна LH1 состоит из 16 или 17 αβ-гетеродимеров, окружающих RC (9-13) в замкнутой петле, но в других основных комплексах трансмембранные пептиды нарушают целостность окружающего LH1, тем самым способствуя диффузии хинола/хинона между RC и комплексом цитохрома bc1 (11, 13-15). Пурпурное фототрофное растение Rhodopseudomonas (Rps.) является модельным организмом, позволяющим понять перенос энергии и электронов, поддерживающий фотосинтез. Первая кристаллическая структура Rps. Модель комплекса RC-LH1 у Rps. palustris представляет собой RC, окруженный 15 гетеродимерными петлями LH1, которые прерываются неизвестным белком, называемым «белком W» (14). Белок W впоследствии был идентифицирован как RPA4402, который представляет собой нехарактеризованный белок массой 10,5 кДа с тремя предсказанными трансмембранными спиралями (TMH) (16). Мы предлагаем переименовать ген rpa4402, кодирующий белок W, в pufW, чтобы соответствовать номенклатуре, используемой для генов, кодирующих субъединицы RC-L, M (pufL, pufM) и LH1α, β (pufA, pufB). Интересно, что белок W присутствует только примерно в 10% RC-LH1, что указывает на то, что Rps. palustris производит два разных комплекса RC-LH1. В данной работе представлены высокоразрешенные криоэлектронно-микроскопические (крио-ЭМ) структуры двух основных комплексов: одного с белком W и 14 αβ-гетеродимерами, и другого без белка W и с замкнутой петлей LH1 из 16 гетеродимеров. Наша структура представляет собой качественный скачок в понимании комплекса RC-LH1 у Rps. palustris, поскольку мы проанализировали гомогенную популяцию каждого варианта и получили достаточное разрешение для четкого определения каждого пептида, связанных пигментов, а также соответствующих липидов и хинонов. Сравнение этих структур показывает, что три белка TMH-W, которые до сих пор не были обнаружены ни в одном другом комплексе RC-LH1, создают хиноновый канал для ускорения обмена хинонов/хинолонов. Было идентифицировано несколько консервативных сайтов связывания липидов и хинонов, и мы выявили новое конформационное изменение после объединения хинона и RC, которое может быть подходящим для RC фотосистемы II (PSII) оксигенированных фототрофных организмов. Наши результаты позволяют получить новые данные о кинетике связывания и обмена хинона/хинолона в основном комплексе RC-LH1 пурпурных фототрофных бактерий.
Для облегчения детального изучения двух комплексов, обнаруженных в Rps. palustris, мы изолировали каждый RC-LH1 биохимическими методами. Комплекс с дефицитом белка W (далее именуемый ΔpufW) был очищен из штамма, лишенного гена pufW (16), и может быть получен только один комплекс RC-LH1. Комплекс, содержащий белок W, продуцируется штаммом. Белок W этого штамма модифицирован 10-кратным His-тегом на С-конце, так что комплекс, содержащий белок W, может эффективно связываться с большинством недостающих белков W путем иммобилизации металла. Комплекс эффективно разделяется (16) с помощью аффинной хроматографии (IMAC).
Как показано на рисунке 1, оба комплекса содержат трехсубъединичный реакционный центр (RC-L, RC-M и RC-H), окруженный антенной LH1. Структура комплекса без белка W с разрешением 2,80 Å показывает 16 αβ-гетеродимеров, образующих замкнутую петлю LH1, полностью окружающую реакционный центр; далее этот комплекс обозначается как комплекс RC-LH116. Структура комплекса, содержащего белок W, с разрешением 2,65 Å имеет 14-гетеродимер LH1, прерываемый белком W; далее этот комплекс обозначается как RC-LH114-W.
(A и B) Поверхностное представление соединения. (C и D) Связанные пигменты, представленные в виде стержней. (E и F) Комплексы, наблюдаемые с цитоплазматической поверхности, имеют пептиды и субъединицы LH1, представленные схематически, и пронумерованы по часовой стрелке от промежутка белок-W [в соответствии с нумерацией Rba. комплекс сфероидов (13)]. Для LH1-α цвет белковой субъединицы желтый; для LH1-β цвет белковой субъединицы синий; для белка-W белок красный; для RC-H - голубой; для RC-L - оранжевый; для RC-M - пурпурный. Кофакторы представлены стержнями, зеленым цветом обозначены молекулы BChl и BPh a, фиолетовым - каротиноиды, а желтым - молекулы UQ10. (G и H) Увеличенное изображение зазора между белком и W в эквивалентной области комплекса RC-LH114-W (G) и комплекса RC-LH116 (H). Кофакторы отображены в виде объемных изображений, хелатированный хинон показан синим цветом. Зазор между белком и W выделен синей пунктирной линией на рисунке (G), а небольшие отверстия, через которые хинон/хинолол диффундирует по кольцу LH116, выделены черной пунктирной линией на рисунке (H).
На рисунке 1 (A и B) показан RC, окруженный открытыми или закрытыми массивами гетеродимеров LH1αβ, каждый из которых связывает два BChl и один каротиноид (рисунок 1, C и D). Предыдущие исследования показали, что Rps является комплексом LH1. В биосинтетическом пути спирулины ксантин эти виды содержат смешанные популяции каротиноидов (17). Однако спиропирроксантин является доминирующим каротиноидом, и его плотность удовлетворительна. Поэтому мы решили смоделировать спироксантин во всех сайтах связывания LH1. Альфа- и бета-полипептиды представляют собой одиночные трансмембранные связки с короткими мембранными наружными областями (рисунок 1, A, B, E и F). Хотя плотность 17 остатков на С-конце не наблюдалась, альфа-полипептид был расщеплен от Met1 до Ala46 в обоих комплексах. В RC-LH116 β-полипептид был восстановлен от Gly4 до Tyr52, а в RC-LH114-W — от Ser5 до Tyr52. Плотность 3 или 4 N-концевых или 13 C-концевых остатков не наблюдалась (рисунок S1). Масс-спектрометрический анализ смешанного комплекса RC-LH1, полученного из штамма дикого типа, показал, что отсутствующий регион является результатом гетерологического расщепления этих пептидов (рисунки S1 и S2). Также наблюдалось N-концевое формилирование α-Met1 (f). Анализ показал, что α-пептид состоит из остатков fMet1 до Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, а β-пептид — из остатков Ser2 до Ala53, что хорошо согласуется с картой электронной плотности при низкой температуре.
Координация α-His29 и β-His36 приводит к тому, что BChls располагаются лицом к лицу; каждый αβ-гетеродимер объединяется со своими соседями, образуя открытую петлю (RC-LH114-W) или замкнутую петлю (RC-LH116) вокруг массива пигментов, связанных с экситонами (рис. 1, C и D). По сравнению с полосой поглощения 877 нм у RC-LH114-W, красное смещение поглощения 880 нм у RC-LH116 составляет 3 нм (рис. 2A). Однако спектр кругового дихроизма практически одинаков (рис. 2B), что указывает на то, что, несмотря на явное различие между открытыми и замкнутыми петлями, локальное окружение BChls очень похоже. Смещение поглощения в красную сторону может быть результатом уменьшения теплового движения и повышения стабильности замкнутого контура (18, 19), изменения связи пигментов, вызванного замкнутым контуром (20, 21), или комбинации этих двух эффектов (11).
(A) Спектр поглощения в ультрафиолетовом/видимом/ближнем инфракрасном диапазоне, пики которого отмечены соответствующими пигментами и нормированы по пику BPh при 775 нм. (B) Спектр кругового дихроизма, нормированный по поглощению BChl при 805 нм. (C и D) Выбранные спектры ΔA из спектров поглощения RC-LH114-W (C) и RC-LH116 (D) с временным разрешением. Для лучшей сопоставимости все спектры нормированы по ∆A от −A при 0,2 пс. (E) Скорость окисления цитохрома c2 после облучения в присутствии различных концентраций UQ2 (см. рисунок S8 для исходных данных). (F) В клетках, выращенных при низкой, средней или высокой интенсивности света (10, 30 или 300 мкМм⁻² с⁻¹, соответственно), определяется соотношение субъединиц белка W и RC-L в очищенном комплексе и в разделенной мембране. Уровень белка определяется методом электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) и иммуноанализом (см. рисунок S9 для исходных данных). Соотношение определяется относительно очищенного комплекса RC-LH114-W. Стехиометрическое соотношение RC-L к белку W в комплексе составляет 1:1.
Белки BChls в положении 1 в деформированной петле αβ14 комплекса RC-LH114-W (рис. 1, A, C и E) находятся ближе к первичному донору RC (P) на 6,8 Å, чем эквивалентные белки BChls в комплексе RC-LH116 (рис. 1, B, D и F, и рис. S3); однако кинетика переходного поглощения двух комплексов показывает, что для RC-LH114-W и RC-LH116 постоянные времени переноса энергии возбуждения от LH1 к RC составляют 40 ±4 и 44 ±3 пс (рис. 2). (рис. 2, C и D, рис. S4 и таблица S2). Также не наблюдается существенной разницы в переносе электронов внутри RC (рис. S5 и соответствующий дополнительный текст). Мы предполагаем, что тесное соответствие времени переноса энергии между LH1 и RC-P обусловлено схожим расстоянием, углом и потенциальной энергией большинства BChl в двух петлях LH1. По-видимому, исследование энергетической структуры LH1 для достижения минимального расстояния происходит не быстрее, чем прямой перенос энергии из неоптимальных участков в RC. Открытая петля LH1 в RC-LH114-W также может подвергаться незначительному тепловому движению в условиях низких температур для структурного анализа, и при комнатной температуре наблюдается более длинная αβ14-кольцевая конформация, чем расстояние пигментации βBChl в положении RC 1.
Комплекс RC-LH116 содержит 32 BChl и 16 каротиноидов, и его общее расположение идентично тому, что было получено из Thermochromatium (Tch.) pidpidum [идентификатор базы данных белков (PDB) 5Y5S] (9), штамма Thiorhodovibrio (Trv.) 970 (идентификатор PDB 7C9R) (12) и зеленых водорослей (Blc.viridis) (идентификатор PDB 6ET5) (10). После выравнивания наблюдались лишь небольшие отклонения в положениях αβ-гетеродимеров, особенно 1-5, 15 и 16 (рисунок S6). Присутствие белка W оказывает существенное влияние на структуру LH1. Три трансмембранных сегмента (ТМЗ) соединены короткими петлями, при этом N-концевой сегмент находится со стороны просвета комплекса, а C-концевой — со стороны цитоплазмы (рис. 1А и 3, А–D). Белок W в значительной степени гидрофобен (рис. 3B), а ТМЗ2 и ТМЗ3 взаимодействуют с LH1αβ-14, образуя трансмембранную поверхность (рис. 3, B и E–G). Интерфейс в основном состоит из остатков Phe, Leu и Val в трансмембранной области. Эти остатки расположены в стопке с гидрофобными аминокислотами и пигментами αβ-14. Некоторые полярные остатки также вносят вклад во взаимодействие, включая водородную связь между W-Thr68 и β-Trp42 на поверхности полости комплекса (рис. 3, F и G). На поверхности цитоплазмы Gln34 находится рядом с кетогруппой каротиноидов αβ-14. Кроме того, была определена молекула н-додецил-β-d-мальтозида (β-DDM), и ее гидрофобный хвост простирался до границы раздела между белком W и αβ-14, а липидный хвост, возможно, расположен в теле. Мы также заметили, что С-концевые области определения белков W и RCH находятся очень близко, но не в пределах области образования специфических взаимодействий (рис. 1, A и E). Однако, возможно, существуют взаимодействия в неопределенных С-концевых аминокислотах этих двух белков, что может обеспечить механизм привлечения белка W во время сборки комплекса RC-LH114-W.
(A) Белок W, расположенный на границе раздела с LH1αβ14 в схематическом изображении, имеет стержнеобразную боковую цепь (красный цвет), показанную на части диаграммы электростатического потенциала (прозрачная серая поверхность с уровнем контура 0,13). (B) Белок W представлен гидрофобной цветной поверхностью. Полярные и заряженные области показаны голубым цветом, гидрофобные области — белым, а сильно гидрофобные области — оранжевым. (C и D) Белок W представлен в схематическом изображении, его ориентация такая же, как в (A) (C), и повернута на 180° (D). В соответствии с положением в последовательности, различимые остатки имеют радужную цветовую схему, где N-концевой — синий, а C-концевой — красный. (E) Белок W в том же ракурсе, что и в (A), а остатки на границе раздела белок W:LH1 представлены стержнями с прикрепленными метками. (F) Белок W повернут на 90° относительно (E) и LH1αβ14 на схематическом изображении, а также относительно остатков интерфейса на столбчатом изображении. Выступающие остатки бета-полипептида обозначены. Кофактор показан в виде полосы, соответствующей цвету рисунка 1, разложившийся β-DDM показан серым цветом, а кислород — красным. (G) Изображение на рисунке (F) повернуто на 180°, при этом отчетливо видны остатки обозначенного альфа-полипептида.
Белок W заменяет αβ-гетеродимер (15-й на рисунке 1F), предотвращая тем самым замыкание петли и наклон первых трех αβ-гетеродимеров. Было замечено, что максимальный угол наклона первого αβ-1-гетеродимера относительно нормали к пленке составлял от 25° до 29° (рисунок 1, A и E), который был сформирован наклоном αβ-1 от 2° до 8° в RC A sharp contrast-LH116 (рисунок 1, B и F). Второй и третий гетеродимеры наклонены под углами от 12° до 22° и от 5° до 10° соответственно. Из-за стерических препятствий RC наклон αβ-1 не включает вторую пару αβ (которая соответствует 16-му αβ на рисунке 1F), образуя таким образом четкий зазор в кольце LH1 (рисунок 1, A и E). Из-за отсутствия двух αβ-гетеродимеров, сопровождающегося потерей четырех BChl и двух каротиноидов, ни один из каротиноидов не связывается с скрученной субъединицей αβ-1, в результате чего кольцо LH114-W содержит 13 вегетарианских каротиноидов и 28 BChl. Оценки локального разрешения двух комплексов в областях αβ1–7 ниже, чем у остальной части петли LH1, что может отражать присущую пластичность субъединицы LH1, прилегающей к сайту QB RC (рисунок 4).
Изображения RC-LH114-W (A и B) и RC-LH116 (C и D) показаны с одного и того же вида сверху/сбоку (A и B) (A и C) и поверхности полости, показанной на рис. 1 (B и D). Цветовые обозначения приведены справа.
Единственный другой характерный основной комплекс со стехиометрическим соотношением 1:14 — это димер RC-LH1-PufX из Rhodococcus sphaeroides (Rba.) (13). Однако белок W и PufX не имеют очевидной гомологии и оказывают существенное влияние на соответствующие структуры LH1. PufX представляет собой единственный трансмембранный суффикс с N-концевым цитоплазматическим доменом, который взаимодействует с цитоплазматической стороной субъединицы RC-H (13) в положении, соответствующем LH116αβ-16 из Rps. palustris. PufX создает канал для обмена хинона/хинолона между RC-LH1 и комплексом цитохрома bcl и присутствует во всех основных комплексах Rba. sphaeroides (13). Хотя интерфейс мономер-мономер находится в Rba. Димер sphaeroides RC-LH1-PufX расположен в позиции связывания белка W в RC-LH114-W, а зазор, образованный PufX и белком W, находится в эквивалентном положении (рис. S7A). Зазор в RC-LH114-W также совпадает с гипотетическим хиноновым каналом (8) Pseudomonas rosea LH1, который образован пептидами, не связанными с белком W или PufX (рис. S7B). Кроме того, хиноновый канал в Blc. Изумрудно-зеленый LH1, образованный путем исключения одной γ-субъединицы (7), расположен в аналогичном положении (рис. S7C). Хотя эти хиноновые/хинолольные каналы опосредованы разными белками, их появление в общем положении в комплексе RC-LH1, по-видимому, является примером конвергентной эволюции, указывая на то, что зазор, созданный белком W, может действовать как хиноновый канал.
Зазор в петле LH114-W позволяет формировать непрерывную мембранную область между внутренним пространством комплекса RC-LH114-W и основной мембраной (рис. 1G), а не соединять два домена через белковую пору, как в белках. Комплекс RC-LH116 похож на закрытый комплекс Tch. Needle-like (22) (рис. 1H). Поскольку диффузия хинона через мембрану происходит быстрее, чем диффузия через узкий белковый канал, открытая петля LH114-W может обеспечить более быстрый оборот RC, чем закрытая петля LH116, и диффузия хинона в RC может быть более ограниченной. Чтобы проверить, влияет ли белок W на превращение хинонов через RC, мы провели анализ окисления цитохрома при определенной концентрации убихинона 2 (UQ2) (аналог природного UQ10 с более коротким изопреновым хвостом) (рис. 2E). Хотя присутствие хелатированного хинона затрудняет точное определение кажущейся константы Михаэлиса (RC-LH114-W и RC-LH116 подходят для концентраций 0,2±0,1 мкМ и 0,5±0,2 мкМ соответственно), максимальная скорость RC-LH114-W (4,6±0,2 e-RC-1 с-1) на 28±5% выше, чем у RC-LH116 (3,6±0,1 e-RC-1 с-1).
Первоначально мы оценили, что белок W присутствует примерно в 10% основного комплекса (16); здесь показатели заполнения клеток, растущих при низкой, средней и высокой освещенности, составляют 15±0,6%, 11±1% и 0,9±0,5% соответственно (рис. 2F). Количественное сравнение масс-спектрометрии показало, что добавление гистидинового тега не снижает относительное содержание белка W по сравнению со штаммами дикого типа (P = 0,59), поэтому эти уровни не являются артефактом модифицированного белка W (рис. S10). Однако такое низкое содержание белка W в комплексе RC-LH1 может позволить некоторым RC переключаться с ускоренной скоростью, тем самым смягчая более медленный обмен хинона/хинолона в комплексе RC-LH116. Мы заметили, что высокая степень заполнения светом противоречит недавним данным транскриптомики, которые указывают на то, что экспрессия гена pufW увеличивается при сильном освещении (Рисунок S11) (23). Разница между транскрипцией pufW и включением белка W в комплекс RC-LH1 вызывает путаницу и может отражать сложную регуляцию белка.
В RC-LH114-W размещены и смоделированы 6 молекул кардиолипина (CDL), 7 молекул фосфатидилхолина (POPC), 1 молекула фосфатидилглицерола (POPG) и 29 молекул β-DDM, а также 6 молекул CDL, 24 молекулы POPC, 2 молекулы POPG и 12 молекул β-DDM. RC-LH116 (рис. 5, A и B). В этих двух структурах CDL почти всегда расположен на цитоплазматической стороне комплекса, тогда как POPC, POPG и β-DDM в основном расположены на люминальной стороне. Две молекулы липида и детергента были выделены в области αβ-1–αβ-6 комплекса RC-LH114-W (рис. 5A), и пять — в эквивалентной области RC-LH116 (рис. 5B). На другой стороне комплекса было обнаружено больше липидов, в основном CDL, накапливающихся между RC и αβ-7 до αβ-13 (рис. 5, A и B). Другие структурно определенные липиды и детергенты расположены вне кольца LH1, а хорошо определенные ацильные цепи простираются между субъединицами LH1, предварительно обозначенные как β-DDM в RC-LH114-W и определенные как β-DDM в RC. Смесь β-DDM и POPC-LH116. Сходное положение хелатирующих липидов и детергентов в нашей структуре указывает на то, что они являются физиологически значимыми сайтами связывания (рис. S12A). Положения эквивалентных молекул в Tch также хорошо согласуются. Gentle и Trv. Штамм 970 RC-LH1s (рисунок S12, B-E) (9, 12) и остатки, образующие водородные связи в головной группе липида, показали достаточно хорошую консервацию в выравнивании последовательностей (рисунок S13), что указывает на то, что консервативный CDL, связывающийся с RC (24), эти участки могут быть консервативными в комплексе RC-LH1.
(A и B) Пептиды RC-LH114-W (A) и RC-LH116 (B) представлены схематическими изображениями, а пигменты — стержнями, согласно цветовой схеме на рисунке 1. Липиды показаны красным цветом, а детергенты — серым. UQ, связанный с сайтами RC QA и QB, обозначен желтым цветом, а изолированный UQ — синим. (C и D) Те же изображения, что и (A) и (B), но без липидов. (E–G) Увеличенное изображение Q1(E), Q2(F) и Q3(G) из RC-LH116 с боковыми цепями, влияющими друг на друга. Водородные связи показаны черными пунктирными линиями.
В RC-LH116 как RC QA, так и QB UQ, участвующие в переносе электронов в процессе разделения заряда, разлагаются в своих сайтах связывания. Однако в RC-LH114-W хинон QB не был идентифицирован и будет подробно рассмотрен ниже. В дополнение к хинонам QA и QB, в структуре RC-LH114-W в соответствии с их хорошо разрешенными головными группами (расположенными в Q1 и Q2 соответственно) выделены две хелатированные молекулы UQ (расположенные между кольцами RC и LH1). Рисунок 5C). К Q1 отнесены две изопреновые единицы, а карта электронной плотности разрешает все 10 изопреновых хвостов Q2. В структуре RC-LH116 были идентифицированы три хелатированные молекулы UQ10 (Q1-Q3, Рисунок 5D), и все молекулы имеют четкую электронную плотность по всей длине хвоста (Рисунок 5, D-G). В обеих структурах положения хиноновых головных групп Q1 и Q2 демонстрируют превосходную согласованность (рис. S12F), и они взаимодействуют только с RC. Q1 расположен у входа в W-зазор RC-LH114-W (рис. 1G и 5, C, D и E), а Q2 расположен вблизи сайта связывания QB (рис. 5, C, D и F). Консервативные остатки L-Trp143 и L-Trp269 находятся очень близко к Q1 и Q2 и обеспечивают потенциальные π-стекинг-взаимодействия (рис. 5, E и F, и рис. S12). L-Gln88, расположенный на расстоянии 3,0 Å от дистального атома кислорода Q1, образует сильную водородную связь (рис. 5E); этот остаток консервативен во всех RC, за исключением наиболее удаленного (рис. S13). L-Ser91 консервативно замещен Thr в большинстве других RC (рис. S13), находится на расстоянии 3,8 Ангстрем от метильного кислорода Q1 и может образовывать слабые водородные связи (рис. 5E). Q3, по-видимому, не имеет специфического взаимодействия, но расположен в гидрофобной области между субъединицей RC-M и субъединицами LH1-α 5–6 (рис. 5, D и G). Q1, Q2 и Q3 или расположенные рядом хелатированные хиноны также были обнаружены в Tch. Gentle, Trv. Strain 970 и Blc. Структура ириса (9, 10, 12) указывает на консервативный вспомогательный сайт связывания хинона в комплексе RC-LH1 (рис. S12G). Значения пяти разложившихся UQ в RC-LH116 хорошо согласуются с 5,8±0,7 для каждого комплекса, определенными методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), в то время как значения трех разложившихся UQ в RC-LH114-W ниже измеренного значения 6,2±0,3 (рис. S14), что указывает на наличие неразрешенных молекул UQ в структуре.
Псевдосимметричные полипептиды L и M содержат по пять трансмембранных спиралей (TMH) и образуют гетеродимер, который объединяет один димер бактериохлорофилла (BChl), два мономера BChl, два мономера бактериофага (BPh), одно негемовое железо и одну или две молекулы UQ10. Благодаря наличию водородных связей на концевой кетоновой группе и ее известному накоплению в Rps, каротиноиды включаются в M-субъединицу, которая называется цис-3,4-дегидроородопин. Виды (25). Внешний мембранный домен RC-H закреплен на мембране одной трансмембранной спиралей (TMH). Общая структура RC аналогична трехсубъединичной структуре RC родственных видов (таких как Rba). sphaeroides (идентификатор PDB: 3I4D). Макроциклы BChl и BPh, каротиноидный остов и негемовое железо перекрываются в пределах диапазона разрешения этих структур, как и головная группа UQ10 в сайте QA и хинон QB в RC-LH116 (рисунок S15).
Наличие двух структур RC с различными коэффициентами заполнения сайта QB предоставляет новую возможность для изучения последовательных конформационных изменений, сопровождающих связывание хинона QB. В комплексе RC-LH116 хинон QB расположен в полностью связанном «проксимальном» положении (26), но в RC-LH114-W хинон QB отсутствует. В RC-LH114-W хинон QB отсутствует, что удивительно, поскольку этот комплекс активнее, чем комплекс RC-LH116 со структурно определенным хиноном QB. Хотя два кольца LH1 хелатируют около шести хинонов, пять из них структурно определены в закрытом кольце RC-LH116, тогда как только три структурно ограничены в открытом кольце RC-LH114-W. Увеличение структурной неупорядоченности может отражать более быструю замену участков QB в RC-LH114-W, более быструю кинетику хинона в комплексе и повышенную вероятность пересечения петли LH1. Мы предполагаем, что отсутствие UQ в участке QB RC-LH114-W может быть результатом более сложного и более активного комплекса, и участок QB RC-LH114-W немедленно застыл в процессе оборота UQ. Конкретная стадия (закрытие входа в участок QB) отражает конформацию этой активности.
Без QB происходит сопутствующее вращение L-Phe217 в положение, несовместимое со связыванием UQ10, поскольку это вызовет пространственное столкновение с первым изопреновым звеном хвоста (рис. 6A). Кроме того, очевидны основные конформационные изменения, особенно в спирали de (короткая спираль в петле между TMH D и E), где L-Phe217 смещается в карман связывания QB, и вращение L-Tyr223 (рис. 6A) для разрыва водородной связи с каркасом M-Asp45 и закрытия входа в сайт связывания QB (рис. 6B). Спираль de поворачивается у своего основания, атом Cα L-Ser209 смещается на 0,33 Å, а атом Cα L-Val221 — на 3,52 Å. В TMH D и E не наблюдается никаких изменений, они совпадают в обеих структурах (рис. 6A). Насколько нам известно, это первая структура в природном реакционном центре, которая закрывает сайт QB. Сравнение с полной (связанной с QB) структурой показывает, что перед восстановлением хинона требуется конформационное изменение, чтобы он мог войти в хинон. L-Phe217 вращается, образуя π-стекинг-взаимодействие с головной группой хинона, и спираль смещается наружу, позволяя скелету L-Gly222 и боковой цепи L-Tyr223 образовать сеть водородных связей со стабильной структурой водородных связей (рис. 6, A и C).
(A) Перекрывающееся схематическое изображение голограммы (цепь L, оранжевый/цепь M, пурпурный) и апо-структуры (серый), в которой ключевые остатки представлены в виде стержнеобразного изображения. UQ10 представлен желтой полосой. Пунктирная линия указывает на водородные связи, образованные во всей структуре. (B и C) Поверхностное изображение аполипопротеина и всей кольцевой структуры, с выделением кислорода боковой цепи L-Phe217 синим цветом и L-Tyr223 красным цветом соответственно. Субъединица L оранжевая; субъединицы M и H не окрашены. (D и E) Аполипопротеин (D) и весь (E) сайт RC QB [окрашены по (A) соответственно] и фотосистема II Thermophilus thermophilus (зеленый, синий с пластиковым хиноном; PDB ID: 3WU2) Выравнивание (58).
Неожиданно, хотя имеется несколько структур QB-дефицитных RC без LH1, конформационные изменения, наблюдаемые в этом исследовании, ранее не были описаны. К ним относятся структуры с дефицитом QB из Blc. viridis (идентификатор PDB: 3PRC) (27), Tch. tepidum (идентификатор PDB: 1EYS) (28) и Rba. sphaeroides (идентификатор PDB: 1OGV) (29), все из которых практически идентичны своей общей структуре QB. Тщательное изучение 3PRC показало, что молекулы детергента LDAO (лаурилдиметиламиноксида) связываются у входа в положение QB, что может препятствовать перестройке в закрытую конформацию. Хотя LDAO не разлагается в том же положении в 1EYS или 1OGV, эти RC были приготовлены с использованием одного и того же детергента и, следовательно, могут давать одинаковый эффект. Кристаллическая структура Rba. Сокристаллизованный с цитохромом c2 комплекс Sphaeroides RC (идентификатор PDB: 1L9B) также, по-видимому, имеет закрытый сайт QB. Однако в этом случае N-концевой регион полипептида RC-M (взаимодействующий с сайтом связывания QB через водородную связь остатка тирозина на спирали Q) принимает неестественную конформацию, и конформационное изменение QB далее не исследовалось (30). Обнадёживает то, что мы не наблюдали подобной деформации полипептида M в структуре RC-LH114-W, которая почти идентична N-концевому региону RC-LH116 RC. Следует также отметить, что после удаления антенны LH1 на основе детергента аполипопротеиновые комплексы RC в PDB были разрешены, что исключило внутренние пулы хинонов и липидов в зазоре между RC и внутренней поверхностью окружающего кольца LH1 (31, 32). Реактор остается функциональным, поскольку сохраняет все кофакторы, за исключением разлагаемого хинона QB, который менее стабилен и часто теряется в процессе приготовления (33). Кроме того, известно, что удаление LH1 и природных циклических липидов из реактора может влиять на его функции, например, сокращать продолжительность жизни разделенного зарядом состояния P+QB (31, 34, 35). Поэтому мы предполагаем, что существование локального кольца LH1, окружающего реактор, может поддерживать «закрытый» участок QB, тем самым сохраняя локальную среду вблизи QB.
Хотя аполипопротеин (без хинона QB) и полная структура представляют собой лишь два снимка оборота сайта QB, а не серию событий, есть признаки того, что связывание может быть ограничено, чтобы предотвратить повторное связывание гидрохиноном для ингибирования субстратного ингибирования. Взаимодействие хинолола и хинона вблизи сайта QB аполипопротеина может быть различным, что приводит к его отторжению RC. Давно предполагалось, что конформационные изменения играют роль в связывании и восстановлении хинонов. Способность замороженных RC восстанавливать хиноны после темновой адаптации нарушена (36); рентгеновская кристаллография показывает, что это повреждение обусловлено тем, что хиноны QB застревают в «дистальной» конформации примерно в 4,5 Å от активного проксимального положения (26), 37). Мы предполагаем, что эта дистальная конформация связывания представляет собой снимок промежуточного состояния между аполипопротеином и полной кольцевой структурой, которое следует за начальным взаимодействием с хиноном и раскрытием сайта QB.
Реактор типа II, обнаруженный в комплексе ФСII некоторых фототрофных бактерий и цианобактерий, водорослей и растений, обладает структурной и функциональной консервацией (38). Структурное выравнивание, показанное на рисунке 6 (D и E), подчеркивает сходство между реакторами ФСII и сайтом QB бактериального комплекса реакторов. Это сравнение долгое время служило моделью для изучения тесно связанных систем связывания и восстановления хинонов. Предыдущие публикации предполагали, что конформационные изменения сопровождаются восстановлением хинонов в ФСII (39, 40). Поэтому, учитывая эволюционную консервацию реакторов, этот ранее не наблюдавшийся механизм связывания может быть применим и к сайту QB реакторов ФСII у оксигенированных фототрофных растений.
Штаммы Rps ΔpufW (немеченый pufW с делецией) и PufW-His (C-концевой белок W с 10-кратной His-меткой, экспрессируемый из природного локуса pufW). Штамм palustris CGA009 был описан в нашей предыдущей работе (16). Эти штаммы и изогенный родительский штамм дикого типа были получены из морозильной камеры путем посева небольшого количества клеток на чашку Петри с агаром PYE (каждый по 5 г/л) (хранился в LB при -80 °C, содержащем 50% (вес/объем) глицерина), дрожжевым экстрактом и сукцинатом [1,5% (вес/объем)]. Чашку Петри инкубировали в течение ночи в темноте при комнатной температуре в анаэробных условиях, а затем освещали белым светом (~50 мкмоль·м⁻²·с⁻¹), обеспечиваемым галогенными лампами OSRAM 116 Вт (RS Components, Великобритания), в течение 3–5 дней до появления одной колонии. Одну колонию использовали для инокуляции 10 мл среды M22+ (41), дополненной 0,1% (вес/объем) аминокислот казеина (далее именуемой M22). Культуру выращивали в условиях низкого содержания кислорода в темноте при 34°C с перемешиванием при 180 об/мин в течение 48 часов, а затем 70 мл культуры инокулировали в тех же условиях в течение 24 часов. Полуаэробную культуру объемом 1 мл инокулировали в 30 мл среды М22 в 30-мл универсальную прозрачную стеклянную бутылку с завинчивающейся крышкой и облучали при перемешивании (~50 мкмоль·м⁻²·с⁻¹) в течение 48 часов стерильным магнитным перемешивающим стержнем. Затем 30 мл культуры инокулировали примерно в 1 литр культуры в тех же условиях, после чего эту культуру использовали для инокуляции примерно 9 литров культуры, облучаемой при ~200 мкмоль·м⁻²·с⁻¹ в течение 72 часов. Клетки собирали центрифугированием при 7132 RCF в течение 30 минут, ресуспендировали в ~10 мл 20 мМ трис-HCl (pH 8,0) и хранили при -20°C до использования.
После размораживания к ресуспендированным клеткам добавляют кристаллы дезоксирибонуклеазы I (Merck, Великобритания), лизозима (Merck, Великобритания) и две таблетки ингибитора голофермента протеазы Roche (Merck, Великобритания). В камере высокого давления French 20 000 psi (Aminco, США) клетки разрушают 8-12 раз. После удаления неразрушенных клеток и нерастворимых остатков центрифугированием при 18 500 RCF в течение 15 минут при 4°C мембрану осаждают из пигментированного лизата центрифугированием при 113 000 RCF в течение 2 часов при 43 000°C. Растворимую фракцию удаляют, а окрашенную мембрану ресуспендируют в 100-200 мл 20 мМ трис-HCl (pH 8,0) и гомогенизируют до исчезновения видимых агрегатов. Суспендированную мембрану инкубировали в 20 мМ трис-HCl (pH 8,0) (Anatrace, США), содержащем 2% (вес/объем) β-DDM, в течение 1 часа в темноте при 4°C с осторожным перемешиванием. Затем центрифугировали при 70°C для растворения 150 000 RCF при 4°C в течение 1 часа для удаления остаточных нерастворимых веществ.
Солюбилизирующая мембрана из штамма ΔpufW была нанесена на ионообменную колонку DEAE Sepharose объемом 50 мл с тремя объемами колонки (CV) связывающего буфера [20 мМ трис-HCl (pH 8,0), содержащего 0,03% (вес/объем) β-DDM]. Колонку промыли двумя объемами связывающего буфера, а затем промыли двумя объемами связывающего буфера, содержащего 50 мМ NaCl. Комплекс RC-LH116 элюировали линейным градиентом от 150 до 300 мМ NaCl (в связывающем буфере) при 1,75 CV, а оставшийся связывающий комплекс элюировали связывающим буфером, содержащим 300 мМ NaCl, при 0,5 CV. Соберите спектр поглощения в диапазоне от 250 до 1000 нм, сохраните фракцию с отношением поглощения (A880/A280) больше 1 в диапазоне от 880 до 280 нм, разбавьте ее дважды в буфере для связывания и повторите ту же процедуру на колонке DEAE. При очистке разбавьте фракции с отношением A880/A280 выше 1,7 и отношением A880/A805 выше 3,0, проведите третий цикл ионного обмена и сохраните фракции с отношением A880/A280 выше 2,2 и отношением A880/A805 выше 5,0. Частично очищенный комплекс был концентрирован до ~2 мл в центрифужном фильтре Amicon с порогом отсечения молекулярной массы 100 000 (MWCO) (Merck, Великобритания) и нанесен на колонку для гель-хроматографии Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, США), содержащую 200 мМ NaCl буфер, а затем элюирован тем же буфером при 1,5 CV. Были собраны спектры поглощения фракции, полученной методом гель-хроматографии, и концентрированы спектры поглощения с соотношением A880/A280 более 2,4 и соотношением A880/A805 более 5,8 до 100 A880, после чего они были немедленно использованы для подготовки сеток для крио-ТЭМ или для хранения. Хранить при -80°C до необходимости использования.
Солюбилизирующая мембрана из штамма PufW-His была нанесена на колонку HisPrep FF Ni-NTA Sepharose объемом 20 мл (20 мМ трис-HCl (pH 8,0), содержащий 200 мМ NaCl и 0,03% (вес/вес)) в буфере IMAC (GE Healthcare). v) β-DDM]. Колонку промывали пятью объемами буфера IMAC, а затем пятью объемами буфера IMAC, содержащего 10 мМ гистидина. Основной комплекс элюировали из колонки пятью буферами IMAC, содержащими 100 мМ гистидина. Фракцию, содержащую комплекс RC-LH114-W, концентрируют до ~10 мл в перемешиваемом резервуаре, оснащенном фильтром Amicon 100 000 MWCO (Merck, Великобритания), разбавляют в 20 раз связывающим буфером, а затем добавляют к 25 мл в колонку DEAE Sepharose, предварительно используя четыре CV, связанных с буфером. Промойте колонку четырьмя буферами для связывания CV, затем элюируйте комплекс на восьми CV с линейным градиентом от 0 до 100 мМ NaCl (в буфере для связывания), а оставшиеся четыре CV содержат 100 мМ буфера для связывания. Остаточные комплексы, элюированные на хлориде натрия, в сочетании с фракциями с соотношением A880/A280 выше 2,4 и соотношением A880/A805 выше 4,6, были концентрированы до ~2 мл в центрифужном фильтре Amicon 100 000 MWCO и заполнены 1,5 CV предварительно уравновешенной буфером колонкой для гель-хроматографии Superdex 200 16/600, а затем элюированы тем же буфером на протяжении 1,5 CV. Соберите спектры поглощения фракций, полученных методом эксклюзионной хроматографии, и сконцентрируйте спектры поглощения с соотношением A880/A280 более 2,1 и соотношением A880/A805 более 4,6 до 100 A880, которые немедленно используйте для приготовления замороженных сеток для ТЭМ или храните при -80°C до необходимости.
Для приготовления низкотемпературных сеток для ТЭМ использовали погружной морозильник Leica EM GP. Комплекс разбавляли в буфере IMAC до оптической плотности A880, равной 50, затем 5 мкл наносили на недавно обработанную тлеющим разрядом медную сетку QUANTIFOIL 1.2/1.3 с углеродным покрытием (Agar Scientific, Великобритания). Сетку инкубировали при 20 °C и 60% относительной влажности в течение 30 с, затем просушивали промокательной бумагой в течение 3 с и охлаждали жидким этаном при -176 °C.
Данные по комплексу RC-LH114-W были записаны на eBIC (Electronic Bioimaging Center) (British Diamond Light Source) с помощью микроскопа Titan Krios, работающего при ускоряющем напряжении 300 кВ, номинальном увеличении 130 000× и энергии 20 эВ. Для записи изображений в режиме счета использовался детектор Gatan 968 GIF Quantum с пиковым детектором K2. Калиброванный размер пикселя составляет 1,048 Å, а скорость дозы — 3,83 е-Å⁻²с⁻¹. Видеозапись производилась в течение 11 секунд и делилась на 40 частей. С помощью области с углеродным покрытием проводилась перефокусировка микроскопа, после чего собиралось по три видеозаписи из каждой области. В общей сложности было собрано 3130 видеозаписей со значениями расфокусировки от -1 до -3 мкм.
Данные для комплекса RC-LH116 были собраны с использованием того же микроскопа в лаборатории биоструктур Астербери (Университет Лидса, Великобритания). Сбор данных проводился в счетном режиме с увеличением 130 тыс., а размер пикселя был откалиброван до 1,065 Å при дозе 4,6 е-Å-2с-1. Видеозапись велась в течение 12 секунд и была разделена на 48 частей. В общей сложности было собрано 3359 видеозаписей со значениями расфокусировки от -1 до -3 мкм.
Вся обработка данных выполняется в конвейере Relion 3.0 (42). Используйте Motioncorr 2 (43) для коррекции движения пучка путем взвешивания дозы, а затем используйте CTFFIND 4.1 (44) для определения параметра CTF (функция передачи контраста). Типичные микрофотографии после этих начальных этапов обработки показаны на рисунке 2. S16. Шаблон автоматического выбора генерируется путем ручного выбора около 250 пикселей из 1000 частиц в 250-пиксельном кадре без эталонной двухмерной (2D) классификации, тем самым отбрасывая те классификации, которые соответствуют загрязнению образца или не имеют различимых характеристик. Затем был выполнен автоматический выбор всех микрофотографий, и для RC-LH114-W было отобрано 849 359 частиц, а для комплекса RC-LH116 — 476 547 частиц. Все выбранные частицы прошли два раунда нереферентной 2D-классификации, и после каждого запуска частицы, соответствующие критериям наличия углеродной области, загрязнения образца, отсутствия очевидных особенностей или сильно перекрывающихся частиц, были отброшены, в результате чего было получено 772 033 (90,9%) и 359 678 (75,5%) частиц. Эти частицы использовались для 3D-классификации RC-LH114-W и RC-LH116 соответственно. Начальная 3D-референтная модель была сгенерирована с использованием метода стохастического градиентного спуска. Используя начальную модель в качестве эталона, выбранные частицы были классифицированы на четыре категории в 3D. Используя модель в этой категории в качестве эталона, была выполнена 3D-детализация частиц в самой большой категории, затем использован начальный низкочастотный фильтр 15 Å для покрытия области растворителя, добавлены 6 пикселей мягких краев, и пиксели были обработаны для коррекции функции передачи модуляции пика Gatan K2 верхнего детектора. Для набора данных RC-LH114-W исходная модель была модифицирована путем удаления сильной плотности по краям маски (отсоединенной от плотности основного комплекса в UCSF Chimera). Полученные модели (разрешение RC-LH114-W и RC-LH116 составляет 3,91 и 4,16 Å соответственно) используются в качестве эталона для второго раунда 3D-классификации. Используемые частицы сгруппированы в исходный 3D-класс и не содержат сильной корреляции с окрестностями. Отсутствует перекрытие или отсутствие очевидных структурных особенностей. После второго раунда 3D-классификации была выбрана категория с самым высоким разрешением [для RC-LH114-W одна категория содержит 377 703 частицы (44,5%), для RC-LH116 две категории, в общей сложности 260 752 частицы (54,7%), причем они одинаковы только при выравнивании после первоначального вращения с небольшим отличием]. Выбранные частицы повторно извлекаются в 400-пиксельный бокс и уточняются с помощью 3D-уточнения. Маска растворителя генерируется с использованием исходного низкочастотного фильтра 15 Å, расширения карты на 3 пикселя и мягкой маски на 3 пикселя. После каждого шага выполняется уточнение CTF для каждой частицы, коррекция движения для каждой частицы и второй раунд уточнения CTF для каждой частицы, 3D-уточнение, маскирование растворителя и постобработка для дальнейшего уточнения полученной текстуры. Используя значение отсечки FSC (коэффициент корреляции Фурье-оболочки) 0,143, разрешение окончательных моделей RC-LH114-W и RC-LH116 составляет 2,65 и 2,80 Å соответственно. Кривая FSC окончательной модели показана на рисунке 2. S17.
Все последовательности белков загружены из UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). Для построения гомологической модели RC, содержащей последовательности белков RC-L, RC-M и RC-H, использовалась программа SWISS-MODEL (45), а в качестве шаблона использовалась кристаллическая структура Rba. sphaeroides RC (PDB ID: 5LSE) (46). Используйте инструмент «fit map» в UCSF Chimera, чтобы подогнать сгенерированную модель к карте (47), улучшить структуру белка и добавить кофактор [4×BChl a (название остатка в библиотеке мономеров = BCL), 2×BPh a (BPH), один или два вида UQ10 (U10), одно негемовое железо (Fe) и один 3,4-дигидрогексакарбонилхолин (QAK)] с помощью Coot (48). Поскольку QAK отсутствует в библиотеке мономеров, он был параметризован с помощью инструмента eLBOW в PHENIX (49).
Далее была построена субъединица LH1. Первоначально для автоматического построения части последовательности LH1 использовался инструмент автоматического построения в PHENIX (49) с использованием карты и последовательностей белков LH1-α и LH1-β в качестве входных данных. Выбиралась наиболее полная субъединица LH1, извлекалась и загружалась в Coot, вручную добавлялась недостающая последовательность, и вручную уточнялась вся структура, прежде чем добавлять два BCl (BCL) и спириллоксантин (CRT) [в соответствии с соответствующей плотностью Rps комплекса LH1 и известным содержанием каротиноидов. Вид (17)]. Копировалась полная субъединица LH1, и с помощью инструмента «Карта стыковки» UCSF Chimera выполнялась стыковка в соседней немоделируемой области плотности LH1, а затем уточнялась в Coot; процесс повторялся до тех пор, пока не были смоделированы все субъединицы LH1. Для структуры RC-LH114-W путем извлечения нераспределенной плотности в Coot, белок сегментируется из оставшихся небелковых компонентов на карте химеры USCF, и инструмент Autobuild используется для создания начальной модели, а оставшиеся субъединицы (белок-W) моделируются в PHENIX (49). Добавьте любые недостающие последовательности к полученной модели в Coot (48), а затем вручную уточните всю субъединицу. Оставшаяся нераспределенная плотность соответствует комбинации липидов (идентификаторы библиотеки мономеров PDB: CDL = CDL, POPC = 6PL и POPG = PGT), детергента β-DDM (LMT) и молекул UQ10 (U10). Используйте оптимизацию PHENIX (49) и ручную оптимизацию в Coot (48) для совершенствования полной начальной модели до тех пор, пока статистические характеристики модели и визуальное качество соответствия не смогут быть улучшены. Наконец, используйте LocScale (50) для уточнения локальной карты, а затем выполните несколько других циклов моделирования нераспределенной плотности и автоматической и ручной оптимизации.
Соответствующие пептиды, кофакторы и другие липиды и хиноны, связанные в пределах своих плотностей, показаны на рисунках 1 и 2 (S18–S23). Статистическая информация об итоговой модели представлена ​​в таблице S1.
Если не указано иное, спектры поглощения в УФ/видимом/ИК диапазоне были получены на спектрофотометре Cary60 (Agilent, США) с интервалом 1 нм в диапазоне от 250 нм до 1000 нм и временем интегрирования 0,1 с.
Разбавьте образец в кварцевой кювете с длиной оптического пути 2 мм до оптической плотности A880, равной 1, и соберите спектр поглощения в диапазоне от 400 до 1000 нм. Спектры кругового дихроизма были получены на спектрополяриметре Jasco 810 (Jasco, Япония) с интервалом 1 нм в диапазоне от 400 до 950 нм при скорости сканирования 20 нм/мин.
Молярный коэффициент экстинкции определяется путем разбавления основного комплекса до A880 приблизительно 50. Разбавьте объем 10 мкл в 990 мкл связывающего буфера или метанола и немедленно соберите спектр поглощения, чтобы минимизировать деградацию БХЛ. Содержание БХЛ в каждом образце метанола рассчитывалось по коэффициенту экстинкции при 771 нм, равному 54,8 мМ-1 см-1, и определялся коэффициент экстинкции (51). Разделите измеренную концентрацию БХЛ на 32 (RC-LH114-W) или 36 (RC-LH116), чтобы определить концентрацию основного комплекса, которая затем используется для определения спектра поглощения того же образца, собранного в буфере. Коэффициент экстинкции. Для каждого образца проводили три повторных измерения, и для расчета использовали среднее значение поглощения максимума Qy БХЛ. Коэффициент экстинкции RC-LH114-W, измеренный при 878 нм, составляет 3280±140 мМ⁻¹ см⁻¹, тогда как коэффициент экстинкции RC-LH116, измеренный при 880 нм, составляет 3800±30 мМ⁻¹ см⁻¹.
Количественное определение UQ10 проводилось согласно методу (52). Вкратце, обращенно-фазовая ВЭЖХ (ОФ-ВЭЖХ) выполнялась с использованием системы Agilent 1200 HPLC. Растворите около 0,02 нмоль RC-LH116 или RC-LH114-W в 50 мкл смеси метанола и хлороформа 50:50, содержащей 0,02% (вес/объем) хлорида железа(III), и введите предварительно уравновешенную колонку Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4,6 мм. Растворение происходит со скоростью 1 мл-1 мин-1 при 40°C в растворителе для ВЭЖХ (метанол:2-пропанол 80:20) на колонке ×25 см. Проведите изократическую элюцию в растворителе для ВЭЖХ для мониторинга поглощения при 275 нм (UQ10), 450 нм (каротиноиды) и 780 нм (BChl) в течение 1 часа. Интегрированный пик на хроматограмме при 275 нм на отметке 25,5 мин не содержал других обнаруживаемых соединений. Интегрированная площадь используется для расчета молярного количества экстрагированного UQ10 относительно калибровочной кривой, рассчитанной на основе введения чистых стандартов от 0 до 5,8 нмоль (рисунок S14). Каждый образец анализировался в трех повторениях, а указанная погрешность соответствует стандартному отклонению среднего значения.
Раствор, содержащий комплекс RC-LH1 с максимальным поглощением Qy 0,1, был приготовлен с использованием 30 мкМ восстановленного цитохрома c2 из сердца лошади (Merck, Великобритания) и от 0 до 50 мкМ UQ2 (Merck, Великобритания). Для каждой концентрации UQ2 было приготовлено три образца по 1 мл, которые инкубировали в течение ночи в темноте при 4°C для обеспечения полной адаптации к темноте перед измерением. Раствор загружали в модульный спектрофотометр OLIS RSM1000, оснащенный дифракционной решеткой 300 нм/500 линий, входным отверстием 1,24 мм, средним отверстием 0,12 мм и выходным отверстием 0,6 мм. На входе в фотоумножитель образца и эталонный фотоумножитель был установлен длинноволновый фильтр 600 нм для исключения возбуждающего света. Поглощение регистрировали при 550 нм с временем интегрирования 0,15 с. Свет возбуждения излучается светодиодом M880F2 (Thorlabs Ltd., Великобритания) с длиной волны 880 нм по оптоволоконному кабелю с интенсивностью 90% через контроллер DC2200 (Thorlabs Ltd., Великобритания) и направляется на источник света под углом 90°. Измерительный луч направлен напротив зеркала, чтобы вернуть свет, который изначально не был поглощен образцом. Измерение абсорбции проводилось за 10 секунд до начала освещения в течение 50 секунд. Затем абсорбция дополнительно измерялась в течение 60 секунд в темноте для оценки степени спонтанного восстановления цитохрома c23+ хинололом (см. рисунок S8 для исходных данных).
Данные обрабатывались путем аппроксимации линейной начальной скоростью в диапазоне от 0,5 до 10 с (в зависимости от концентрации UQ2) и усреднения скоростей для всех трех образцов при каждой концентрации UQ2. Концентрация RC-LH1, рассчитанная по соответствующему коэффициенту экстинкции, использовалась для преобразования скорости в каталитическую эффективность, которая затем строилась в программе Origin Pro 2019 (OriginLab, США) и аппроксимировалась моделью Михаэлиса-Ментен для определения кажущихся значений Km и Kcat.
Для измерений переходного поглощения образец RC-LH1 разбавляли до концентрации ~2 мкМ в буфере IMAC, содержащем 50 мМ аскорбата натрия (Merck, США) и 0,4 мМ тербутина (Merck, США). Аскорбиновая кислота используется в качестве жертвенного донора электронов, а трет-бутаклофен — в качестве ингибитора QB, чтобы гарантировать, что основной донор RC остается восстановленным (то есть не фотоокисленным) на протяжении всего процесса измерения. Приблизительно 3 мл образца добавляют в специальную вращающуюся ячейку (диаметром около 0,1 м, 350 об/мин) с длиной оптического пути 2 мм, чтобы обеспечить достаточное время для темновой адаптации образца в пути лазера между импульсами возбуждения. Для усиления лазерного излучения в системе Ti:Sapphire (Spectra Physics, США) использовались лазерные импульсы длительностью ~100 фс, которые возбуждали образец на длине волны 880 нм с частотой повторения 1 кГц (20 нДж для ближнего ИК-диапазона или 100 нДж для видимого диапазона). Перед сбором данных образец подвергали воздействию возбуждающего света в течение примерно 30 минут. Воздействие приведет к инактивации QA (возможно, снизив активность QA в один или два раза). Однако следует отметить, что этот процесс обратимый, поскольку после длительного периода темновой адаптации RC медленно вернется к активности QA. Для измерения переходных спектров использовался спектрометр Helios (Ultrafast Systems, США) с задержкой от -10 до 7000 пс. Для разгруппировки, объединения и стандартизации наборов данных использовалось программное обеспечение Surface Xplorer (Ultrafast Systems, США). Для получения дифференциальных спектров, связанных с распадом, используйте программный пакет CarpetView (Light Conversion Ltd., Литва), чтобы использовать объединенный набор данных, или используйте функцию, которая свертывает несколько показателей степени с откликом прибора для аппроксимации спектральной эволюции на одной длине волны в программе Origin (OriginLab, США).
Как упоминалось выше (53), была приготовлена ​​фотосинтетическая пленка, содержащая комплекс LH1, лишенный как RC, так и периферической антенны LH2. Мембрану разбавляли в 20 мМ трис-буфере (pH 8,0), а затем помещали в кварцевую кювету с оптическим путем 2 мм. Для возбуждения образца использовали лазерный импульс мощностью 30 нДж при длине волны 540 нм с задержкой от -10 до 7000 пс. Обрабатывали набор данных, как описано для образца Rps.pal.
Мембрану осаждали центрифугированием при 150 000 RCF в течение 2 часов при 4°C, затем ее абсорбцию при 880 нм ресуспендировали в 20 мМ трис-HCl (pH 8,0) и 200 мМ NaCl. Мембрану растворяли медленным перемешиванием в 2% (вес/объем) β-DDM в течение 1 часа в темноте при 4°C. Образец разбавляли в 100 мМ триэтиламмонийкарбонате (pH 8,0) (TEAB; Merck, Великобритания) до концентрации белка 2,5 мг/мл (анализ Bio-Rad). Дальнейшую обработку проводили по ранее опубликованному методу (54), начиная с разведения 50 мкг белка в 50 мкл TEAB, содержащего 1% (вес/объем) лаурата натрия (Merck, Великобритания). После ультразвуковой обработки в течение 60 с образец восстанавливали 5 мМ трис(2-карбоксиэтил)фосфином (Merck, Великобритания) при 37°C в течение 30 минут. Для S-алкилирования образец инкубировали с 10 мМ метил-S-метилтиометансульфонатом (Merck, Великобритания) и добавляли его из 200 мМ изопропанолового раствора в течение 10 минут при комнатной температуре. Протеолитическое расщепление проводили добавлением 2 мкг смеси трипсина/эндопротеиназы Lys-C (Promega, Великобритания) и инкубировали при 37°C в течение 3 часов. Лауратный поверхностно-активный агент экстрагировали добавлением 50 мкл этилацетата и 10 мкл 10% (об/об) трифторуксусной кислоты (ТФУ) хроматографической чистоты (Thermo Fisher Scientific, Великобритания) и перемешиванием на вортексе в течение 60 с. Разделение фаз было достигнуто центрифугированием при 15 700 об/мин в течение 5 минут. В соответствии с протоколом производителя, для тщательного отбора и обессоливания нижней фазы, содержащей пептид, использовалась центрифужная колонка C18 (Thermo Fisher Scientific, Великобритания). После высушивания вакуумным центрифугированием образец растворяли в 0,5% ТФК и 3% ацетонитриле, и 500 нг анализировали методом нанопоточной обращенно-фазовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией, используя параметры системы, подробно описанные ранее.
Используйте MaxQuant v.1.5.3.30 (56) для идентификации и количественного определения белков, чтобы найти базу данных протеома Rps. palustris (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). Данные масс-спектрометрической протеомики депонированы в ProteomeXchange Alliance через партнерский репозиторий PRIDE (http://proteomecentral.proteomexchange.org) под идентификатором набора данных PXD020402.
Для анализа методом ВЭЖХ с электрораспылительной ионизацией и масс-спектрометрией комплекс RC-LH1 был приготовлен из Rps дикого типа. Используя ранее опубликованный метод (16), концентрация белка, полученного в клетках palustris, составляла 2 мг мл-1 в 20 мМ Hepes (pH 7,8), 100 мМ NaCl и 0,03% (вес/объем) β- (анализ Bio-Rad) ) DDM. В соответствии с протоколом производителя, используя набор для 2D-очистки (GE Healthcare, США), экстрагировали 10 мкг белка методом осаждения и растворили осадок в 20 мкл 60% (объем/объем) муравьиной кислоты (FA), 20% (объем/объем) ацетонитрила и 20% (объем/объем) воды. Пять микролитров анализировали методом ВЭЖХ (Dionex RSLC) с масс-спектрометрией (Maxis UHR-TOF, Bruker). Для разделения используйте колонку MabPac 1,2 × 100 мм (Thermo Fisher Scientific, Великобритания) при температуре 60 °C и скорости потока 100 мкл/мин, с градиентом от 85% (об./об.) растворителя A [0,1% (об./об.) муравьиной кислоты и 0,02% (об./об.) трифторуксусной кислоты] до 85% (об./об.) растворителя B [0,1% (об./об.) муравьиной кислоты и 0,02% (об./об.) в 90% (об./об.) ацетонитрила и трифторуксусной кислоты]. Используя стандартный источник электрораспылительной ионизации и параметры по умолчанию, в течение более 60 минут масс-спектрометр получает значения m/z от 100 до 2750 (отношение массы к заряду). С помощью инструмента FindPept (https://web.expasy.org/findpept/) на биоинформатическом портале ExPASy сопоставьте масс-спектр с субъединицами комплекса.
Клетки выращивали в течение 72 часов при освещенности 100 мл среды NF-low (10 мкМм-2 с-1), medium (30 мкМм-2 с-1) или high (300 мкМм-2 с-1). Среду M22 (среда M22, в которой исключен сульфат аммония, а сукцинат натрия заменен ацетатом натрия) помещали в 100-мл бутылку с завинчивающейся крышкой (23). В течение пяти 30-секундных циклов наносили стеклянные шарики размером 0,1 микрона в объемном соотношении 1:1 для лизиса клеток и охлаждали на льду в течение 5 минут. Нерастворимые вещества, неразрушенные клетки и стеклянные шарики удаляли центрифугированием при 16 000 RCF в течение 10 минут в настольной микроцентрифуге. Разделение мембраны проводилось в роторе Ti 70.1 с частотой вращения 100 000 RCF в 20 мМ трис-HCl (pH 8,0) с градиентом сахарозы 40/15% (масс./масс.) в течение 10 часов.
Как описано в нашей предыдущей работе, иммунодетекция His-метки на PufW (16). Вкратце, очищенный основной комплекс (11,8 нМ) или мембрана, содержащая ту же концентрацию RC (определенную путем окисления, вычитания восстановленного дифференциального спектра и соответствия загрузки на окрашенном геле) в 2-кратном буфере для загрузки SDS (Merck, Великобритания), разбавленном в два раза. Белки разделяли на реплике 12% бис-трис NuPage геля (Thermo Fisher Scientific, Великобритания). Гель окрашивали кумасси бриллиантовым синим (Bio-Rad, Великобритания) для загрузки и визуализации субъединицы RC-L. Белок со второго геля переносили на активированную метанолом поливинилиденфторидную (PVDF) мембрану (Thermo Fisher Scientific, Великобритания) для иммуноанализа. ПВДФ-мембрану блокировали в 50 мМ трис-HCl (pH 7,6), 150 мМ NaCl, 0,2% (об/об) Tween-20 и 5% (вес/об) сухого обезжиренного молока, а затем инкубировали с первичными антителами против His-метки (в разбавленном буфере для антител [50 мМ трис-HCl (pH 7,6), 150 мМ NaCl и 0,05% (об/об) Tween-20] в разведении 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, США) в течение 4 часов. После трехкратного промывания в течение 5 минут в буфере для антител мембрану обрабатывали вторичными антителами против мыши, конъюгированными с пероксидазой хрена (Sigma-Aldrich, Великобритания) (разведение 1:10 000 в буфере для антител). Инкубировали для обнаружения (5 минут после трех промываний в буфере для антител) с использованием хемилюминесцентного субстрата WESTAR ETA C 2.0 (Cyanagen, Италия) и прибора Amersham Imager 600 (GE Healthcare, Великобритания).
Построив распределение интенсивности каждого окрашенного геля или полосы иммуноанализа, интегрировав площадь под пиком и рассчитав соотношение интенсивностей RC-L (окрашенный гель) и белка-W (иммуноанализ), обработайте изображение в ImageJ (57). Эти соотношения были преобразованы в молярные соотношения, предполагая, что соотношение RC-L к белку-W в чистом образце RC-LH114-W составляет 1:1, и соответствующим образом нормализуйте весь набор данных.
Дополнительные материалы к этой статье можно найти по адресу http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution. Статья разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение в любом формате при условии надлежащего цитирования оригинальной работы.
Примечание: Мы просим вас указать адрес электронной почты только для того, чтобы человек, которого вы рекомендуете этой странице, знал, что вы хотите, чтобы он увидел это письмо, и что это не спам. Мы не будем собирать адреса электронной почты.
Этот вопрос используется для проверки того, являетесь ли вы посетителем, и предотвращения автоматической отправки спама.
Дэвид Дж. К. Суэйнсбери, Парк Цянь, Филип Дж. Джексон, Кейтлин М. Фарис, Дариуш М. Недзведзки, Элизабет К. Мартин, Дэвид А. Фармер, Лорна А. Мэлоун, Ребекка Ф. Томпсон, Нил А. Рэнсон, Дэниел П. Каннифф, Марк Дж. Дикман, Дьюи Холтен, Кристин Кирмайер, Эндрю Хичкок, К. Нил Хантер
Высокоразрешенная структура комплекса световой ловушки 1 в реакционном центре позволяет получить новые данные о динамике хинона.
Дэвид Дж. К. Суэйнсбери, Парк Цянь, Филип Дж. Джексон, Кейтлин М. Фарис, Дариуш М. Недзведзки, Элизабет К. Мартин, Дэвид А. Фармер, Лорна А. Мэлоун, Ребекка Ф. Томпсон, Нил А. Рэнсон, Дэниел П. Каннифф, Марк Дж. Дикман, Дьюи Холтен, Кристин Кирмайер, Эндрю Хичкок, К. Нил Хантер
Высокоразрешенная структура комплекса световой ловушки 1 в реакционном центре позволяет получить новые данные о динамике хинона.
©2021 Американская ассоциация содействия развитию науки. все права защищены. AAAS является партнером HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef и COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.