Текущий адрес: Кёльн 50931, Германия, Кёльнский кластер передовых исследований клеточной стрессовой реакции при заболеваниях, связанных со старением (CECAD).
Нейродегенерация при митохондриальных заболеваниях считается необратимой, поскольку метаболическая пластичность нейронов ограничена, однако влияние митохондриальной дисфункции на клеточную автономию нейронального метаболизма в организме изучено недостаточно. В данной работе мы представляем клеточно-специфический протеом нейронов Пуркинье с прогрессирующим дефицитом окислительного фосфорилирования (OXPHOS), вызванным нарушением динамики слияния митохондрий. Мы обнаружили, что митохондриальная дисфункция вызывает глубокие изменения в области протеомики, которые в конечном итоге приводят к последовательной активации точных метаболических программ перед гибелью клетки. Неожиданно мы выявили явную индукцию пируваткарбоксилазы (PCx) и других антивозрастных ферментов, восполняющих промежуточные продукты цикла трикарбоновых кислот (ЦТК). Ингибирование PCx усугубляет окислительный стресс и нейродегенерацию, указывая на то, что атеросклероз оказывает защитное действие на нейроны, испытывающие дефицит OXPHOS. Восстановление слияния митохондрий в терминально дегенерировавших нейронах полностью обращает вспять эти метаболические характеристики, предотвращая тем самым гибель клеток. Наши результаты выявляют ранее неизвестные пути, обеспечивающие устойчивость к митохондриальной дисфункции, и показывают, что нейродегенерацию можно обратить вспять даже на поздних стадиях заболевания.
Центральная роль митохондрий в поддержании энергетического метаболизма нейронов подчеркивается обширными неврологическими симптомами, связанными с митохондриальными заболеваниями человека. Большинство этих заболеваний вызваны мутациями генов, регулирующих экспрессию митохондриальных генов (1, 2), или разрушением генов, связанных с динамикой митохондрий, что косвенно влияет на стабильность митохондриальной ДНК (мтДНК) (3, 4). Исследования на животных моделях показали, что в ответ на митохондриальную дисфункцию в окружающих тканях могут активироваться консервативные метаболические пути (5-7), что предоставляет важную информацию для углубленного понимания патогенеза этих сложных заболеваний. В отличие от этого, наше понимание метаболических изменений в конкретных типах клеток, вызванных общим нарушением производства митохондриального аденозинтрифосфата (АТФ) в головном мозге, имеет фундаментальное значение (8), подчеркивая необходимость выявления терапевтических мишеней, которые можно использовать для предотвращения или профилактики нейродегенерации (9). Недостаток информации объясняется тем, что нервные клетки, как широко считается, обладают очень ограниченной метаболической гибкостью по сравнению с типами клеток окружающих тканей (10). Учитывая, что эти клетки играют центральную роль в координации снабжения нейронов метаболитами для обеспечения синаптической передачи и реагирования на травмы и заболевания, способность адаптировать клеточный метаболизм к сложным условиям мозговой ткани практически ограничена глиальными клетками (11-14). Кроме того, присущая мозговой ткани клеточная гетерогенность в значительной степени затрудняет изучение метаболических изменений, происходящих в конкретных подгруппах нейронов. В результате мало что известно о точных клеточных и метаболических последствиях митохондриальной дисфункции в нейронах.
Чтобы понять метаболические последствия митохондриальной дисфункции, мы выделили нейроны Пуркинье (НП) на разных стадиях нейродегенерации, вызванной нарушением слияния наружной мембраны митохондрий (Mfn2). Хотя мутации Mfn2 у человека связаны с формой наследственной моторно-сенсорной нейропатии, известной как болезнь Шарко-Мари-Тута типа 2А (15), условное разрушение Mfn2 у мышей является хорошо известным методом индукции нарушения окислительно-фосфорилирования (OXPHOS). Различные нейрональные подтипы (16-19) и результирующий нейродегенеративный фенотип сопровождаются прогрессирующими неврологическими симптомами, такими как двигательные расстройства (18, 19) или мозжечковая атаксия (16). Используя комбинацию методов количественной протеомики без меток (LFQ), метаболомики, визуализации и вирусологии, мы показали, что прогрессирующая нейродегенерация сильно индуцирует экспрессию пируваткарбоксилазы (PCx) и других факторов, участвующих в атеросклерозе периферических нервов (ПН) in vivo. Для проверки значимости этого открытия мы целенаправленно снизили экспрессию PCx в ПН с дефицитом Mfn2 и обнаружили, что эта операция усугубила окислительный стресс и ускорила нейродегенерацию, тем самым доказав, что азооспермия приводит к гибели клеток и метаболической адаптации. Сильная экспрессия MFN2 может полностью предотвратить терминальную дегенерацию ПН с тяжелым дефицитом окислительного фосфорилирования, массивным потреблением митохондриальной ДНК и явно нарушенной митохондриальной сетью, что еще раз подчеркивает, что эта форма нейродегенерации может восстановиться даже на поздней стадии заболевания до гибели клеток.
Для визуализации митохондрий в нейронах PN с нокаутом Mfn2 мы использовали штамм мышей, который позволяет Cre-зависимым митохондриям нацеливать экспрессию Cre желтого флуоресцентного белка (YFP) (mtYFP) (20) и проверили морфологию митохондрий in vivo. Мы обнаружили, что разрушение гена Mfn2 в нейронах PN приводит к постепенному делению митохондриальной сети (рисунок S1A), и самые ранние изменения наблюдались в возрасте 3 недель. В отличие от этого, существенная дегенерация слоя клеток PN, о чем свидетельствует потеря иммуноокрашивания кальбиндином, начиналась только в возрасте 12 недель (рисунок 1, A и B). Несоответствие во времени между самыми ранними изменениями морфологии митохондрий и видимым началом гибели нейронов побудило нас исследовать метаболические изменения, вызванные митохондриальной дисфункцией, до гибели клеток. Мы разработали стратегию, основанную на флуоресцентной проточной цитометрии (FACS), для выделения PN, экспрессирующих YFP (YFP+) (рис. 1C), а также контрольных мышей (Mfn2+/loxP::mtYFP loxP-stop-loxP::L7-cre), далее обозначаемых как CTRL (рис. S1B). Оптимизация стратегии гейтирования на основе относительной интенсивности сигнала YFP позволяет нам очищать YFP+ тело (YFPhigh) PN от не-PN (YFPneg) (рис. S1B) или предполагаемых флуоресцентных фрагментов аксонов/дендритов (YFPlow; рис. S1D, слева), что подтверждено конфокальным микроскопом (рис. S1D, справа). Для проверки идентичности классифицированной популяции мы провели протеомный анализ LFQ, а затем анализ главных компонентов, и обнаружили четкое разделение между клетками YFPhigh и YFPneg (рис. S1C). Клетки YFPhigh показали чистое обогащение известными маркерами PN (например, Calb1, Pcp2, Grid2 и Itpr3) (21, 22), но не обогащение белками, обычно экспрессируемыми в нейронах или других типах клеток (Рисунок 1D). Сравнение образцов в классифицированных клетках YFPhigh, собранных в независимых экспериментах, показало коэффициент корреляции > 0,9, демонстрируя хорошую воспроизводимость между биологическими повторами (Рисунок S1E). В целом, эти данные подтвердили наш план острой и специфической изоляции возможных PN. Поскольку используемая драйверная система L7-cre индуцирует мозаичную рекомбинацию в первую неделю после доставки (23), мы начали отбирать мышей из контрольной группы и группы с условным нокаутом (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre). После завершения рекомбинации в возрасте 4 недель ее называют Mfn2cKO. В качестве конечной точки мы выбрали 8 недель возраста, когда слой ПН был неповрежденным, несмотря на очевидную фрагментацию митохондрий (Рисунок 1B и Рисунок S1A). В общей сложности мы количественно определили 3013 белков, из которых около 22% были основаны на аннотациях MitoCarta 2.0, основанных на митохондриальном протеоме, как митохондрии (Рисунок 1E) (Рисунок 1E) (24). Анализ дифференциальной экспрессии генов, проведенный на 8 неделе, показал, что только 10,5% всех белков имели значительные изменения (Рисунок 1F и Рисунок S1F), из которых 195 белков были подавлены, а 120 белков — активированы (Рисунок 1F). Стоит отметить, что «инновационный анализ путей» этого набора данных показывает, что дифференциально экспрессируемые гены в основном принадлежат к ограниченному набору специфических метаболических путей (Рисунок 1G). Интересно, что, хотя снижение активности путей, связанных с окислительным фосфорилированием и кальциевой сигнализацией, подтверждает индукцию митохондриальной дисфункции в нейронах с дефицитом слияния, другие категории, в основном связанные с метаболизмом аминокислот, значительно активируются, что согласуется с метаболизмом, происходящим в митохондриальных нейронах. Перестройка является последовательной. дисфункция.
(A) Репрезентативные конфокальные фотографии срезов мозжечка мышей CTRL и Mfn2cKO, демонстрирующие прогрессирующую потерю нейронов Пуркинье (кальбиндин, серый); ядра были дополнительно окрашены DAPI. (B) Количественная оценка (A) (однофакторный дисперсионный анализ, ***P<0,001; n = 4–6 кругов от трех мышей). (C) Схема эксперимента. (D) Тепловая карта распределения маркеров, специфичных для клеток Пуркинье (сверху) и других типов клеток (посередине). (E) Диаграмма Венна, показывающая количество митохондриальных белков, идентифицированных в классифицированных нейронах Пуркинье. (F) Вулканическая диаграмма дифференциально экспрессируемых белков в нейронах Mfn2cKO в возрасте 8 недель (пороговое значение значимости 1,3). (G) Анализ путей креативности показывает пять наиболее важных путей повышения (красный) и понижения (синий) в нейронах Пуркинье Mfn2cKO в возрасте 8 недель. Показан средний уровень экспрессии каждого обнаруженного белка. Тепловая карта в оттенках серого: скорректированное значение P. ns — не имеет значения.
Протеомические данные показали, что экспрессия белков комплексов I, III и IV постепенно снижалась. Комплексы I, III и IV содержали основные субъединицы, кодируемые мтДНК, в то время как комплекс II, кодируемый только ядерным геномом, оставался практически неизменным (рис. 2A и рис. S2A). В соответствии с результатами протеомики, иммуногистохимическое исследование срезов ткани мозжечка показало, что уровень субъединицы MTCO1 (субъединица 1 митохондриальной цитохром-С-оксидазы) комплекса IV в PN постепенно снижался (рис. 2B). Уровень субъединицы Mtatp8, кодируемой мтДНК, значительно снижался (рис. S2A), в то время как стационарный уровень субъединицы АТФ-синтазы, кодируемой ядерным геномом, оставался неизменным, что согласуется с известным стабильным комплексом субъединицы F1 АТФ-синтазы при стабильной экспрессии мтДНК. (7). Оценка уровня мтДНК в отсортированных нейронах Mfn2cKO методом ПЦР в реальном времени подтвердила постепенное снижение количества копий мтДНК. По сравнению с контрольной группой, в возрасте 8 недель сохранилось лишь около 20% уровня мтДНК (рис. 2C). В соответствии с этими результатами, для обнаружения ДНК использовалось конфокальное микроскопическое окрашивание нейронов Mfn2cKO, которое показало зависимое от времени потребление митохондриальных нуклеотидов (рис. 2D). Мы обнаружили, что были повышены уровни только некоторых белков, участвующих в деградации митохондриальных белков и стрессовой реакции, включая Lonp1, Afg3l2 и Clpx, а также факторы сборки комплекса OXPHOS. Значительных изменений в уровнях белков, участвующих в апоптозе, обнаружено не было (рис. S2B). Аналогично, мы обнаружили, что каналы митохондрий и эндоплазматического ретикулума, участвующие в транспорте кальция, претерпели лишь незначительные изменения (рис. S2C). Кроме того, оценка белков, связанных с аутофагией, не выявила существенных изменений, что согласуется с видимой индукцией аутофагосом, наблюдаемой in vivo с помощью иммуногистохимии и электронной микроскопии (рис. S3). Однако прогрессирующая дисфункция OXPHOS в PN сопровождается очевидными ультраструктурными изменениями митохондрий. Митохондриальные кластеры можно увидеть в телах клеток и дендритных деревьях PN Mfn2cKO в возрасте 5 и 8 недель, а структура внутренней мембраны претерпела глубокие изменения (рис. S4, A и B). В соответствии с этими ультраструктурными изменениями и значительным снижением мтДНК, анализ острых срезов мозжечка с использованием тетраметилродаминметилового эфира (TMRM) показал, что митохондриальный мембранный потенциал в PN Mfn2cKO значительно снижен (рис. S4C).
(A) Анализ динамики уровня экспрессии комплекса OXPHOS. Учитывались только белки с P<0,05 на 8 неделе (двухфакторный дисперсионный анализ). Пунктирная линия: без корректировки по сравнению с контрольной группой. (B) Слева: пример среза мозжечка, меченного антителом к ​​MTCO1 (масштабная линейка, 20 мкм). Область, занимаемая телами клеток Пуркинье, выделена желтым цветом. Справа: количественная оценка уровней MTCO1 (однофакторный дисперсионный анализ; n = 7–20 клеток, проанализированных от трех мышей). (C) ПЦР-анализ количества копий мтДНК в отсортированных ПН (однофакторный дисперсионный анализ; n = 3–7 мышей). (D) Слева: пример среза мозжечка, меченного антителом к ​​ДНК (масштабная линейка, 20 мкм). Область, занимаемая телами клеток Пуркинье, выделена желтым цветом. Справа: Количественная оценка повреждений мтДНК (однофакторный дисперсионный анализ; n = 5–9 клеток от трех мышей). (E) Пример острого среза мозжечка, показывающий клетки Пуркинье mitoYFP+ ​​(стрелка) в режиме регистрации потенциалов целой клетки. (F) Количественная оценка кривой IV. (G) Репрезентативные записи инъекции деполяризующего тока в клетки Пуркинье CTRL и Mfn2cKO. Верхняя кривая: первый импульс, вызвавший потенциал действия. Нижняя кривая: максимальная частота потенциала действия. (H) Количественная оценка постсинаптических спонтанных входов (sPSP). Репрезентативная кривая записи и ее масштаб показаны на рисунке (I). Однофакторный дисперсионный анализ проводился для n = 5–20 клеток от трех мышей. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего; *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001. (J) Репрезентативные кривые спонтанных потенциалов действия, зарегистрированные в режиме перфорированной регистрации потенциалов целой клетки. Верхняя кривая: максимальная частота потенциала действия. Нижняя кривая: увеличенное изображение одного потенциала действия. (K) Количественно оцените среднюю и максимальную частоту потенциала действия согласно (J). Критерий Манна-Уитни; было проанализировано n = 5 клеток от четырех мышей. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего; не имеет значения.
В 8-недельных нейронах Mfn2cKO PN были обнаружены явные нарушения окислительного фосфорилирования, что указывает на серьезные отклонения в физиологической функции нейронов. Поэтому мы проанализировали пассивные электрические характеристики нейронов с дефицитом окислительного фосфорилирования в возрасте 4-5 и 7-8 недель, проведя электрофизиологические исследования методом пэтч-клемпа на острых срезах мозжечка (рис. 2E). Неожиданно, средний потенциал покоя мембраны и входное сопротивление нейронов Mfn2cKO были аналогичны контрольным, хотя между клетками наблюдались незначительные различия (табл. 1). Аналогично, в возрасте 4-5 недель не было обнаружено значительных изменений в зависимости тока от напряжения (кривая IV) (рис. 2F). Однако ни один нейрон Mfn2cKO в возрасте 7-8 недель не пережил режим IV (этап гиперполяризации), что указывает на явную чувствительность к потенциалу гиперполяризации на этой поздней стадии. В отличие от этого, в нейронах Mfn2cKO деполяризующие токи, вызывающие повторяющиеся разряды потенциалов действия (ПД), хорошо переносятся, что указывает на то, что их общие паттерны разрядов существенно не отличаются от паттернов 8-недельных контрольных нейронов (таблица 1 и рисунок 2G). Аналогично, частота и амплитуда спонтанных постсинаптических токов (сПСТ) были сопоставимы с таковыми в контрольной группе, а частота событий увеличивалась с 4 недель до 5 недель, затем до 7 недель и до 8 недель с аналогичным увеличением (рисунок 2, H и I). Период синаптического созревания в ПН (25). Аналогичные результаты были получены после перфорированных участков ПН. Такая конфигурация предотвращает возможную компенсацию дефектов клеточного АТФ, которая могла бы произойти при регистрации методом пэтч-клемпа всей клетки. В частности, потенциал покоя мембраны и частота спонтанных разрядов нейронов Mfn2cKO не были затронуты (рисунок 2, J и K). В заключение, эти результаты показывают, что нейроны с явной дисфункцией окислительного фосфорилирования хорошо справляются с высокочастотными разрядами, что указывает на наличие компенсаторного механизма, позволяющего им поддерживать электрофизиологические реакции на уровне, близком к нормальному.
Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (однофакторный дисперсионный анализ, множественный сравнительный тест Холма-Сидака; *P<0,05). Номер единицы указан в скобках.
Мы поставили перед собой задачу исследовать, включает ли какая-либо категория в наборе данных протеомики (рис. 1G) пути, которые могут противодействовать тяжелому дефициту OXPHOS, тем самым объясняя, почему пораженные PN могут поддерживать почти нормальную электрофизиологию (рис. 2, E-K). Протеомический анализ показал, что ферменты, участвующие в катаболизме аминокислот с разветвленной цепью (BCAA), были значительно повышены (рис. 3A и рис. S5A), а конечный продукт ацетил-КоА (КоА) или сукцинил-КоА могут восполнять трикарбоксилаты в цикле трикарбоновых кислот (ЦТК) атеросклероза. Мы обнаружили, что содержание трансаминазы BCAA 1 (BCAT1) и BCAT2 увеличилось. Они катализируют первый этап катаболизма BCAA, генерируя глутамат из α-кетоглутарата (26). Все субъединицы, составляющие комплекс дегидрогеназы кетокислот с разветвленной цепью (BCKD), имеют повышенную экспрессию (комплекс катализирует последующее и необратимое декарбоксилирование образующегося углеродного скелета BCAA) (рис. 3A и рис. S5A). Однако в отсортированных PN не было обнаружено очевидных изменений в самом содержании BCAA, что может быть связано с повышенным клеточным поглощением этих незаменимых аминокислот или использованием других источников (глюкозы или молочной кислоты) для восполнения цикла трикарбоновых кислот (рис. S5B). У PN, лишенных окислительного фосфорилирования, также наблюдалось повышение активности расщепления глутамина и трансаминирования в возрасте 8 недель, что может быть отражено в повышении экспрессии митохондриальных ферментов глутаминазы (GLS) и глутаминпируваттрансаминазы 2 (GPT2) (рис. 3, A и C). Стоит отметить, что повышение уровня GLS ограничено сплайсированной изоформой глутаминазы C (GLS-GAC) (изменение Mfn2cKO/CTRL составляет приблизительно 4,5 раза, P = 0,05), и его специфическое повышение уровня в раковых тканях может поддерживать митохондриальную биоэнергетику. (27).
(A) Тепловая карта показывает изменение уровня белка для указанного пути через 8 недель. (B) Пример среза мозжечка, меченного антителом к ​​PCx (масштабная линейка, 20 мкм). Желтая стрелка указывает на тело клетки Пуркинье. (C) Анализ динамики экспрессии белка, идентифицированного как важный кандидат на роль фактора атеросклероза (множественный t-тест, *FDR <5%; n = 3-5 мышей). (D) Вверху: Схематическое изображение различных способов проникновения меченого углерода, содержащегося в трассере [1-13C]пирувата (т.е., через PDH или трансартериальным путем). Внизу: Скрипичная диаграмма показывает процент меченого углерода (M1), превращенного в аспарагиновую кислоту, лимонную кислоту и яблочную кислоту после мечения острых срезов мозжечка [1-13C]пируватом (парный t-тест; ** P <0,01). (E) Комплексный анализ временной истории указанного пути. Учитываются только белки с P<0,05 через 8 недель. Пунктирная линия: значение корректировки отсутствует (двухфакторный дисперсионный анализ; * P <0,05; *** P <0,001). Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего.
В нашем анализе катаболизм BCAA стал одним из ключевых путей повышения активности. Этот факт убедительно свидетельствует о том, что объем вентиляции, поступающий в цикл Кребса, может изменяться у пациентов с периферической нейропатией, испытывающей дефицит OXPHOS. Это может представлять собой важную форму перестройки метаболизма нейронов, которая может оказывать прямое влияние на физиологию и выживаемость нейронов при поддержании тяжелой дисфункции OXPHOS. В соответствии с этой гипотезой, мы обнаружили, что основной антиатеросклеротический фермент PCx повышается (у Mfn2cKO/CTRL изменения примерно в 1,5 раза; рисунок 3A), который катализирует превращение пирувата в оксалоацетат (28), который, как полагают, в тканях мозга экспрессируется только в астроцитах (29, 30). В соответствии с результатами протеомики, конфокальная микроскопия показала, что экспрессия PCx была специфически и значительно повышена в PN с дефицитом OXPHOS, в то время как реактивность PCx в основном ограничивалась соседними глиальными клетками Бергмана в контрольной группе (рис. 3B). Для функциональной проверки наблюдаемого повышения экспрессии PCx мы обрабатывали острые срезы мозжечка меченым изотопом [1-13C]пируватом. Когда пируват окислялся пируватдегидрогеназой (PDH), его изотопная метка исчезала, но включалась в промежуточные продукты цикла трикарбоновых кислот при метаболизме пирувата в сосудистых реакциях (рис. 3D). В подтверждение наших данных протеомики мы наблюдали большое количество маркеров этого меченого изомера в аспарагиновой кислоте срезов Mfn2cKO, в то время как лимонная и яблочная кислоты также демонстрировали умеренную тенденцию, хотя и не значительную (рис. 3D).
В дофаминовых нейронах мышей MitoPark с митохондриальной дисфункцией, вызванной специфическим разрушением гена митохондриального транскрипционного фактора А (Tfam) в дофаминовых нейронах (рисунок S6B), экспрессия PCx также была значительно повышена (31), что указывает на то, что возникновение ацетоновой кислоты при атеросклерозе регулируется дисфункцией нейронального OXPHOS в организме. Стоит отметить, что было обнаружено, что уникальные ферменты (32-34), которые могут экспрессироваться в нейронах, связанных с атеросклерозом, значительно повышают свою активность в нейронах, лишенных окислительного фосфорилирования, такие как пропионил-КоА-карбоксилаза (PCC-A), малонил-КоА, превращающий пропионил-КоА в сукцинил-КоА, и митохондриальный малатдегидрогеназа 3 (ME3), основная роль которого заключается в восстановлении пирувата из малата (рис. 3, А и С) (33, 35). Кроме того, мы обнаружили значительное увеличение активности фермента Pdk3, который фосфорилирует и, таким образом, инактивирует PDH (36), в то время как изменений в активности фермента Pdp1, активирующего PDH, или в самом ферментном комплексе PDH обнаружено не было (рис. 3А). В нейронах Mern2cKO PN наблюдалось последовательное усиление фосфорилирования α1-субъединицы α (PDHE1α) компонента E1 пируватдегидрогеназы комплекса PDH по Ser293 (известному как фактор, ингибирующий ферментативную активность PDH) (рис. S6C). Пируват не имеет сосудистого доступа.
Наконец, мы обнаружили, что суперпуть биосинтеза серина и глицина, связанный с ним митохондриальный фолатный цикл (1C) и биосинтез пролина (рис. 1G и рис. S5C) значительно активируются, согласно сообщениям, в процессе активации. Окружающие ткани активируются при митохондриальной дисфункции (5-7). Конфокальный анализ, подтверждающий эти протеомные данные, показал, что при ПН с отсутствием OXPHOS срезы мозжечка 8-недельных мышей подвергались воздействию серингидроксиметилтрансферазы 2 (SHMT2), ключевого фермента митохондриального фолатного цикла. Наблюдался значительный иммунный ответ (рис. S5D). В 13 острых срезах мозжечка, инкубированных с CU-глюкозой, эксперименты по метаболическому отслеживанию дополнительно подтвердили повышение уровня биосинтеза серина и пролина, указывая на увеличение потока изоформ углерода в серин и пролин (рис. S5E). Поскольку реакции, стимулируемые GLS и GPT2, отвечают за синтез глутамата из глутамина и трансаминирование между глутаматом и α-кетоглутаратом, их повышение указывает на то, что нейроны с дефицитом OXPHOS имеют повышенную потребность в глутамате. Это может быть направлено на поддержание повышенного биосинтеза пролина (рис. S5C). В отличие от этих изменений, протеомный анализ астроцитов мозжечка от мышей Mfn2cKO, специфичных для PN, показал, что эти пути (включая все антипероксидазы) не претерпели значительных изменений в экспрессии, что демонстрирует, что это метаболическое перенаправление избирательно направлено на деградированный PN (рис. S6, D-G).
В заключение, эти анализы выявили значительно различающиеся закономерности временной активации специфических метаболических путей в нейронах. Хотя аномальная функция митохондрий нейронов может приводить к раннему атеросклерозу и ремоделированию 1C (рис. 3E и рис. S5C), и даже к предсказуемым изменениям в экспрессии комплексов I и IV, изменения в синтезе серина de novo становятся очевидными только на поздних стадиях. Дисфункция окислительного фосфорилирования (рис. 3E и рис. S5C). Эти данные определяют последовательный процесс, в котором вызванный стрессом митохондриальный (цикл 1C) и цитоплазматический (биосинтез серина) ответ синергически с увеличением атеросклероза в цикле трикарбоновых кислот перестраивают метаболизм нейронов.
Восьминедельные нейроны с дефицитом OXPHOS способны поддерживать высокочастотную активность возбуждения и претерпевать значительную метаболическую реконнекцию для компенсации митохондриальной дисфункции. Это открытие поднимает интересную возможность того, что даже в этот момент эти клетки могут также получать терапевтическое вмешательство для замедления или предотвращения нейродегенерации. Мы разрешили эту возможность с помощью двух независимых вмешательств. В первом методе мы разработали Cre-зависимый аденоассоциированный вирусный (AAV) вектор, позволяющий избирательно экспрессировать MFN2 в нейронах с дефицитом OXPHOS in vivo (рисунок S7A). AAV, кодирующий MFN2 и флуоресцентный репортерный ген mCherry (Mfn2-AAV), был проверен в первичных культурах нейронов in vitro, что привело к экспрессии MFN2 Cre-зависимым образом и восстановлению митохондриальной морфологии, тем самым предотвращая нейромутацию в нейронах Mfn2cKO (рисунок S7, B, D и E). Далее мы провели эксперименты in vivo по стереотаксической доставке 8-недельного Mfn2-AAV в кору мозжечка мышей Mfn2cKO и контрольных мышей, а также проанализировали 12-недельных мышей (Рисунок 4A). Обработанные мыши Mfn2cKO погибли (Рисунок 1, A и B) (16). Вирусная трансдукция in vivo привела к селективной экспрессии PN в некоторых кругах мозжечка (Рисунок S7, G и H). Инъекция контрольного AAV, экспрессирующего только mCherry (Ctrl-AAV), не оказала существенного влияния на степень нейродегенерации у животных Mfn2cKO. Напротив, анализ Mfn2cKO, трансдуцированных Mfn2-AAV, показал значительный защитный эффект слоя клеток PN (Рисунок 4, B и C). В частности, плотность нейронов практически неотличима от контрольных животных (Рисунок 4, B и C, и Рисунок S7, H и I). Экспрессия MFN1, но не MFN2, одинаково эффективна в предотвращении гибели нейронов (рис. 4C и рис. S7, C и F), что указывает на то, что экспрессия эктопического MFN1 может эффективно компенсировать недостаток MFN2. Дальнейший анализ на уровне отдельных нейронов показал, что Mfn2-AAV в значительной степени восстановил ультраструктуру митохондрий, нормализовал уровни мтДНК и обратил вспять высокую экспрессию антиангиогенного маркера PCx (рис. 4, C-E). Визуальный осмотр спасенных мышей Mfn2cKO в состоянии покоя показал, что их осанка и двигательные симптомы (движения S1-S3) улучшились. В заключение, эти эксперименты показывают, что отсроченное повторное введение MFN2 в нейроны с сильным дефицитом окислительного фосфорилирования достаточно для обращения вспять потребления мтДНК и индукции атеросклероза, тем самым предотвращая дегенерацию аксонов и гибель нейронов in vivo.
(A) Схема, показывающая экспериментальный график инъекции AAV, кодирующего MFN2, при активации указанного метаболического пути. (B) Репрезентативные конфокальные изображения срезов мозжечка 12-недельных мышей Mfn2cKO, трансдуцированных в 8 недель и помеченных антителами к кальбиндину. Справа: Масштабирование аксонных волокон. Масштаб увеличения аксона составляет 450 и 75 мкм. (C) Слева: Количественная оценка плотности клеток Пуркинье в петле трансдукции AAV (AAV+) (однофакторный дисперсионный анализ; n = 3 мыши). Справа: Анализ фокусов мтДНК в трансдуцированных клетках Пуркинье на 12 неделе (непарный t-тест; n = 6 клеток от трех мышей). * P <0,05; ** P <0,01. (D) Репрезентативные электронные микрофотографии ПН из срезов мозжечка Mfn2cKO, трансдуцированных указанными вирусными векторами. Розовая маска иллюстрирует область, занимаемую дендритами, а желтый пунктирный квадрат иллюстрирует увеличенное изображение, представленное справа; n обозначает ядро. Масштабная линейка, 1 мкм. (E) показывает пример окрашивания PCx в ПН, трансдуцированном на 12 неделе. Масштабная линейка, 20 мкм. OE, сверхэкспрессия; FC, изменение в кратности.
Наконец, мы исследовали важность выживания клеток, индуцированного пероксидазой, в периферических нейронах, у которых наблюдалась дисфункция окислительного фосфорилирования. Мы создали mCherry, кодирующий AAV-shRNA (короткую шпилечную РНК), специфически нацеленную на мРНК мышиного PCx (AAV-shPCx), и ввели вирус или его контрольный вариант (AAV-scr) в мозжечок мышей Mfn2cKO. Инъекцию проводили на четвертой неделе жизни (рис. 5A) для достижения эффективного подавления PCx в период, когда экспрессия PCx увеличивалась (рис. 3C), а слой клеток периферических нейронов оставался неповрежденным (рис. 1A). Стоит отметить, что подавление PCx (рис. S8A) приводит к значительному ускорению гибели периферических нейронов, которое ограничивается инфицированным кольцом (рис. 5, B и C). Чтобы понять механизм метаболических эффектов, вызванных повышением регуляции PCx, мы изучили окислительно-восстановительный статус нейронов после нокдауна PCx и одновременной экспрессии оптического биосенсора Grx1-roGFP2 с помощью AAV (рисунок S8, B-D) для оценки относительного изменения окислительно-восстановительного потенциала пептида (38). Затем мы провели двухфотонную флуоресцентную микроскопию с измерением времени жизни флуоресценции (FLIM) на острых срезах мозга 7-недельных мышей Mfn2cKO или контрольных однопометных мышей, чтобы обнаружить потенциальные изменения цитоплазматического окислительно-восстановительного статуса после проверки условий FLIM (рисунок S8, E-G). Анализ показал значительное увеличение степени окисления отдельных нейронов Mfn2cKO, лишенных экспрессии PCx, что отличается от контрольных нейронов или нейронов Mfn2cKO, экспрессирующих только случайную shRNA (рисунок 5, D и E). При снижении экспрессии PCx процент нейронов Mfn2cKO, демонстрирующих сильно окисленное состояние, увеличился более чем в три раза (рисунок 5E), что указывает на то, что повышение экспрессии PCx поддерживало окислительно-восстановительную способность дегенерировавших нейронов.
(A) Схема, показывающая экспериментальный график инъекции AAV, кодирующего shPCx, при активации указанного метаболического пути. (B) Репрезентативные конфокальные фотографии срезов мозжечка 8-недельных мышей Mfn2cKO, трансдуцированных и помеченных антителами к кальциневрину в возрасте 4 недель. Масштабная линейка, 450 мкм. (C) Количественная оценка плотности клеток Пуркинье в петлях, трансдуцированных AAV (однофакторный дисперсионный анализ; n = 3–4 мыши). Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего; ***P<0,001. (D) Репрезентативное изображение FLIM показывает среднюю продолжительность жизни 7-недельных мышей PN, экспрессирующих глутатионовый редокс-сенсор Grx1-roGFP2, в указанных экспериментальных условиях. Соотношение LUT (таблица поиска): интервал времени выживания (в пикосекундах). Масштабная линейка, 25 мкм. (E) Гистограмма показывает распределение значений продолжительности жизни Grx1-roGFP2 из (D) (n=158–368 клеток у двух мышей в каждом условии). Круговая диаграмма над каждой гистограммой показывает количество клеток со значительно большей (красный, окисленный) или меньшей (синий, восстановленный) продолжительностью жизни, превышающей 1 стандартное отклонение средней продолжительности жизни в CTRL-AAV-scr. (F) Предложенная модель демонстрирует защитный эффект повышения экспрессии нейронального PCx.
В целом, представленные здесь данные показывают, что повторная экспрессия MFN2 может полностью восстановить прогрессирующую периферическую нейропатию с тяжелым дефицитом окислительного фосфорилирования, тяжелым истощением мтДНК и крайне аномальной истаподобной морфологией, обеспечивая тем самым непрерывный прогресс даже при запущенных заболеваниях. Нейродегенерация предоставляет обратимые доказательства стадии, предшествующей гибели клеток. Эта степень метаболической гибкости дополнительно подчеркивается способностью нейронов индуцировать атеросклероз (перестройка цикла трикарбоновых кислот), что ингибирует экспрессию PCx в периферических нейропатиях, лишенных окислительного фосфорилирования, и усиливает гибель клеток, тем самым играя защитную роль (рисунок 5F).
В этом исследовании мы представили доказательства того, что реакция нейронов на дисфункцию окислительного фосфорилирования заключается в постепенном приближении к атеросклерозу цикла трикарбоновых кислот посредством дифференциального пути активации, запускаемого метаболическими программами. Мы подтвердили протеомный анализ с помощью множества дополнительных методов и выявили, что при воздействии серьезной митохондриальной дисфункции нейроны обладают ранее неизвестной формой метаболической эластичности. К нашему удивлению, весь процесс перестройки не обязательно обозначает конечное метаболическое состояние, которое постепенно и необратимо сопровождает нейродегенерацию, но наши данные предполагают, что он может представлять собой механизм функциональной компенсации нейронов даже на стадии, предшествующей гибели клетки. Это открытие указывает на то, что нейроны обладают значительной степенью метаболической пластичности в организме. Этот факт доказывает, что последующее повторное введение MFN2 может обратить вспять экспрессию ключевых метаболических маркеров и предотвратить дегенерацию нейронов. Напротив, это ингибирует атеросклероз и ускоряет развитие нервов.
Одним из наиболее интересных результатов нашего исследования является то, что нейроны, лишенные OXPHOS, могут изменять метаболизм цикла трикарбоновых кислот (ЦТК) путем повышения активности ферментов, которые специфически стимулируют атеросклероз. Метаболическая перестройка является распространенной особенностью раковых клеток, некоторые из которых используют глутамин для восполнения промежуточных продуктов ЦТК с целью получения восстановительных эквивалентов, которые приводят в действие дыхательную цепь и поддерживают производство предшественников биосинтеза липидов и нуклеотидов (39, 40). Недавнее исследование показало, что в периферических тканях, испытывающих дисфункцию OXPHOS, восстановление связи между метаболизмом глутамина и глутамата также является важной особенностью (5, 41), где направление поступления глутамина в ЦТК зависит от тяжести повреждения OXPHOS (41). Однако отсутствуют четкие доказательства какого-либо сходства нейрональной метаболической пластичности в организме и ее возможной значимости в контексте заболевания. В недавнем исследовании in vitro было показано, что первичные кортикальные нейроны мобилизуют пулы глутамата для нейротрансмиссии, тем самым способствуя окислительному метаболизму и атеросклерозу в условиях метаболического стресса (42). Стоит отметить, что при фармакологическом ингибировании фермента цикла трикарбоновых кислот сукцинатдегидрогеназы карбоксилирование пирувата, как полагают, поддерживает синтез оксалоацетата в культивируемых гранулярных нейронах мозжечка (34). Однако физиологическая значимость этих механизмов для ткани мозга (где атеросклероз, как полагают, в основном локализуется в астроцитах) все еще имеет важное физиологическое значение (43). В этом случае наши данные показывают, что нейроны, поврежденные окислительным фосфорилированием в организме, могут переключаться на деградацию разветвленных аминокислот и карбоксилирование пирувата, которые являются двумя основными источниками восполнения промежуточных продуктов цикла трикарбоновых кислот. Хотя было высказано предположение о вкладе катаболизма BCAA в энергетический метаболизм нейронов, а также о роли глутамата и ГАМК в нейротрансмиссии (44), доказательств существования этих механизмов in vivo до сих пор нет. Поэтому легко предположить, что дисфункциональные нейроны могут автоматически компенсировать потребление промежуточных продуктов цикла трикарбоновых кислот, обусловленное процессом ассимиляции, за счет усиления атеросклероза. В частности, повышение уровня PCx может быть необходимо для поддержания повышенной потребности в аспарагиновой кислоте, что предполагается в пролиферирующих клетках с митохондриальной дисфункцией (45). Однако наш метаболомный анализ не выявил каких-либо значительных изменений в стационарном уровне аспарагиновой кислоты в нейронах Mfn2cKO (рисунок S6A), что, предположительно, отражает различное метаболическое использование аспарагиновой кислоты между пролиферирующими клетками и постмитотическими нейронами. Хотя точный механизм повышения уровня PCx в дисфункциональных нейронах in vivo еще предстоит охарактеризовать, мы продемонстрировали, что эта преждевременная реакция играет важную роль в поддержании окислительно-восстановительного состояния нейронов, что было показано в экспериментах FLIM на срезах мозжечка. В частности, предотвращение повышения уровня PCx в нейронах может привести к более окисленному состоянию и ускорить гибель клеток. Активация деградации BCAA и карбоксилирование пирувата не являются способами характеристики периферических тканей с митохондриальной дисфункцией (7). Поэтому они, по-видимому, являются приоритетной особенностью нейронов с дефицитом OXPHOS, даже если не единственной, важной для нейродегенерации.
Заболевания мозжечка представляют собой гетерогенный тип нейродегенеративного заболевания, которое обычно проявляется атаксией и часто повреждает нейроны ПН (46). Эта популяция нейронов особенно уязвима к митохондриальной дисфункции, поскольку их селективная дегенерация у мышей достаточна для воспроизведения многих двигательных симптомов, характерных для спиноцеребеллярной атаксии человека (16, 47, 48). Согласно сообщениям, трансгенная мышиная модель с мутантным геном связана со спиноцеребеллярной атаксией человека и имеет митохондриальную дисфункцию (49, 50), что подчеркивает важность изучения последствий дефицита OXPHOS при ПНГ. Поэтому особенно целесообразно эффективно изолировать и изучать эту уникальную популяцию нейронов. Однако, учитывая, что нейроны ПН очень чувствительны к давлению и составляют небольшую долю всей популяции клеток мозжечка, для многих исследований на основе омиксных технологий селективное разделение их как целых клеток по-прежнему остается сложной задачей. Хотя добиться абсолютного отсутствия загрязнения другими типами клеток (особенно тканями взрослых) практически невозможно, мы объединили эффективный этап диссоциации с FACS для получения достаточного количества жизнеспособных нейронов для последующего протеомного анализа и получили довольно высокое покрытие белками (около 3000 белков) по сравнению с существующим набором данных по всему мозжечку (51). Сохраняя жизнеспособность целых клеток, предлагаемый нами метод позволяет нам не только проверять изменения в метаболических путях в митохондриях, но и проверять изменения в их цитоплазматических аналогах, что дополняет использование меток митохондриальной мембраны для обогащения типов клеток новым методом подсчета митохондрий в сложных тканях (52, 53). Описанный нами метод относится не только к изучению клеток Пуркинье, но может быть легко применен к любому типу клеток для изучения метаболических изменений в пораженном мозге, включая другие модели митохондриальной дисфункции.
Наконец, мы выявили терапевтическое окно в процессе этой метаболической перестройки, которое может полностью обратить вспять ключевые признаки клеточного стресса и предотвратить дегенерацию нейронов. Следовательно, понимание функциональных последствий описанной здесь перестройки может дать фундаментальные представления о возможных методах лечения, позволяющих поддерживать жизнеспособность нейронов при митохондриальной дисфункции. Для полного раскрытия применимости этого принципа к другим неврологическим заболеваниям необходимы дальнейшие исследования, направленные на изучение изменений энергетического метаболизма в других типах клеток головного мозга.
Мыши MitoPark были описаны ранее (31). Мыши C57BL/6N с loxP, фланкирующими гены Mfn2, были описаны ранее (18) и скрещены с мышами L7-Cre (23). Полученное потомство с двойной гетерозиготностью затем скрещивали с гомозиготными мышами Mfn2loxP/Mfn2loxP для получения нокаутов гена Mfn2, специфичных для клеток Пуркинье (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). В подгруппе скрещиваний аллель Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP (stop-mtYFP) вводили посредством дополнительных скрещиваний (20). Все процедуры с животными проводились в соответствии с европейскими, национальными и институциональными руководящими принципами и были одобрены Земельным управлением по охране окружающей среды и защите прав потребителей, Северный Рейн-Вестфалия, Германия. Работа с животными также осуществляется в соответствии с рекомендациями Европейской федерации ассоциаций специалистов по лабораторным животным.
После анестезии беременной женщины и проведения цервикальной дислокации, эмбрион мыши изолируют (E13). Кору головного мозга выделяют в сбалансированном солевом растворе Хэнкса (HBSS) с добавлением 10 мМ Hepes и переносят на модифицированную среду Игла Дульбекко, содержащую папаин (20 Ед/мл) и цистеин (1 мкг/мл). Ткань инкубируют в среде DMEM и диссоциируют путем ферментативного переваривания. Клетки инкубируют при 37°C в течение 20 минут, а затем механически измельчают в среде DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки. Клетки высевают на стеклянные покровные пластины, покрытые полилизином, с плотностью 2×10⁶ на чашку Петри диаметром 6 см или с плотностью 0,5×10⁵ клеток/см² для анализа изображений. Через 4 часа среду заменили на бессывороточную среду Neurobasal, содержащую 1% добавки B27 и 0,5 мМ GlutaMax. Затем нейроны поддерживали при температуре 37°C и 5% CO2 на протяжении всего эксперимента и подкармливали один раз в неделю. Для индукции рекомбинации in vitro на второй день in vitro нейроны обрабатывали 3 мкл (24-луночная культуральная чашка) или 0,5 мкл (24-луночный планшет) следующего вирусного вектора AAV9: AAV9.CMV.PI.eGFP.WPRE.bGH (Addgene, каталожный номер 105530-AAV9) и AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, каталожный номер 105545-AAV9).
Комплементарная ДНК мышиных Mfn1 и Mfn2 (полученная из плазмид Addgene № 23212 и № 23213 соответственно) помечена последовательностью V5 (GKPIPNPLLGLDST) на С-конце и слита с mCherry в рамке считывания через последовательность T2A. Grx1-roGFP2 предоставлен TP Dick DFKZ (Немецкий центр исследований рака) из Гейдельберга. Заменив кассету tdTomato с использованием традиционных методов клонирования, кассету субклонировали в основу pAAV-CAG-FLEX-tdTomato (номер ссылки Addgene 28306) для создания векторов pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 и pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2. Аналогичная стратегия была использована для создания контрольного вектора pAAV-CAG-FLEX-mCherry. Для создания конструкции AAV-shPCx необходим плазмидный AAV-вектор (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]), содержащий последовательность ДНК, кодирующую shRNA, нацеленную на мышиный PCx (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′). Под контролем промотора U6 используется mCherry под контролем промотора CMV. Производство вспомогательных AAV-векторов осуществлялось в соответствии с инструкциями производителя (Cell Biolabs). Вкратце, для временной трансфекции клеток 293AAV использовали трансферную плазмиду, несущую гены mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) или Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2), а также кодирующие белки капсида AAV1 и вспомогательные белки. Упаковочную плазмиду получали методом фосфата кальция. Неочищенный вирусный супернатант получали путем циклов замораживания-оттаивания в ванне с сухим льдом/этанолом, а лизированные клетки – в фосфатно-буферном растворе (PBS). Вектор AAV был очищен методом ультрацентрифугирования в прерывистом градиенте иодиксанола (24 часа при 32 000 об/мин и 4°C) и концентрирован с использованием центрифужного фильтра Amicon ultra-15. Титр генома AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2,9×10¹³ копий генома (GC)/мл], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1×10¹² GC/мл), AAV1-CAG-FLEX был измерен, как описано ранее (54), с помощью количественной ПЦР в реальном времени (qPCR) -MFN1-V5 (1,9×10¹³ GC/мл) и AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8,9×10¹² GC/мл).
Первичные нейроны соскабливали в ледяном 1x PBS, центрифугировали, а затем гомогенизировали в лизисном буфере PBS, содержащем 0,5% Triton X-100 / 0,5% дезоксихолата натрия, с добавлением ингибиторов фосфатазы и протеазы (Roche). Количественное определение белка проводили с использованием бицинхониновой кислоты (Thermo Fisher Scientific). Затем белки разделяли методом электрофореза в SDS-полиакриламидном геле и переносили на поливинилиденфторидную мембрану (GE Healthcare). Блокировали неспецифические участки и инкубировали с первичным антителом (подробности см. в таблице S1) в 5% молоке в TBST (трис-буферный солевой раствор с Tween), проводили этапы промывки и инкубировали со вторичным антителом в TBST. Инкубировали с первичным антителом в течение ночи при +4°C. После промывки наносили вторичное антитело на 2 часа при комнатной температуре. Впоследствии, путем инкубации того же блота с антителом к ​​β-актину, была подтверждена та же самая загрузка образца. Детекция осуществлялась путем преобразования в хемилюминесценцию и усиления хемилюминесценции (GE Healthcare).
Нейроны, предварительно высеянные на стеклянные покровные стекла, фиксировали 4%-ным параформальдегидом (PFA)/PBS в указанный момент времени при комнатной температуре в течение 10 минут. Покровные стекла сначала обрабатывали 0,1%-ным раствором Triton X-100/PBS в течение 5 минут при комнатной температуре, а затем блокирующим буфером [3% бычьим сывороточным альбумином (BSA)/PBS]. На второй день покровные стекла промывали блокирующим буфером и инкубировали с соответствующими вторичными антителами, конъюгированными с флуорофором, в течение 2 часов при комнатной температуре; наконец, образцы тщательно промывали в PBS с контрастным окрашиванием 4′,6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI), а затем фиксировали на предметном стекле микроскопа с помощью Aqua-Poly/Mount.
Мышей (самцов и самок) анестезировали внутрибрюшинной инъекцией кетамина (130 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг), а также подкожно вводили анальгетик карпрофен (5 мг/кг). Их помещали в стереотаксический аппарат (Kopf), оснащенный грелкой. Обнажали череп и с помощью стоматологической бормашины истончали часть коры мозжечка, соответствующую костному отростку (от лямбда: хвостовой 1,8, латеральный 1, соответствующий долькам IV и V). Изогнутой иглой шприца аккуратно делали небольшое отверстие в черепе, избегая повреждения сосудов под ним. Затем тонкий стеклянный капилляр медленно вводят в микроотверстие (от -1,3 до -1 на вентральной стороне твердой мозговой оболочки), и 200–300 нл ААВ вводят в микроинжектор (Narishige) с помощью ручных шприцев (Narishige) несколько раз под низким давлением в течение 10–20 минут. После инфузии капилляр оставляют еще на 10 минут, чтобы вирус полностью распространился. После извлечения капилляров кожу аккуратно зашивают, чтобы минимизировать воспаление раны и дать животному восстановиться. Животным в течение нескольких дней после операции давали анальгетики (каспофен), в течение которых тщательно контролировали их физическое состояние, после чего их эвтаназировали в указанный момент времени. Все процедуры проводились в соответствии с европейскими, национальными и институциональными руководящими принципами и были одобрены Земельным управлением по охране окружающей среды и защите прав потребителей (LandesamtfürNatur of Umwelt and Verbraucherschutz), Северный Рейн-Вестфалия, Германия.
Животных анестезировали кетамином (100 мг/кг) и ксилазином (10 мг/кг), а сердце перфузировали сначала 0,1 М PBS, а затем 4% PFA в PBS. Ткань препарировали и фиксировали в 4% PFA/PBS в течение ночи при 4°C. Для приготовления сагиттальных срезов (толщиной 50 мкм) из фиксированного мозга в PBS использовали вибрационный нож (Leica Microsystems GmbH, Вена, Австрия). Если не указано иное, окрашивание свободно плавающих срезов проводили, как описано выше (13), при комнатной температуре и перемешивании. Вкратце, сначала полученные срезы пермеабилизировали 0,5% Triton X-100/PBS в течение 15 минут при комнатной температуре; для некоторых эпитопов (Pcx и Shmt2) вместо этого этапа срезы нагревали в трис-ЭДТА буфере при 80°C (pH 9) в течение 25 минут. Затем срезы инкубировали с первичными антителами (см. Таблицу S1) в блокирующем буфере (3% BSA/PBS) при 4°C в течение ночи при перемешивании. На следующий день срезы промывали блокирующим буфером и инкубировали с соответствующими вторичными антителами, конъюгированными с флуорофором, в течение 2 часов при комнатной температуре; наконец, срезы тщательно промывали в PBS, окрашивали DAPI, а затем фиксировали с помощью AquaPolymount на предметном стекле микроскопа.
Для получения изображений образца использовался лазерный сканирующий конфокальный микроскоп (TCS SP8-X или TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems), оснащенный лазером белого света и диодным ультрафиолетовым лазером 405 нм. Возбуждение флуорофора и сбор сигнала с помощью гибридного детектора (HyDs) осуществлялись с помощью программного обеспечения LAS-X, которое позволяло получать многослойные изображения в режиме последовательной выборки Найквиста: для некачественных панелей это высокодинамичные сигналы (например, в соматических клетках и дендритах, mtYFP). Для определения количества PN в режиме BrightR использовался HyD. Для уменьшения фонового шума применялось стробирование от 0,3 до 6 нс.
Визуализация отсортированных клеток в реальном времени. После сортировки в среде Neurobasal-A, содержащей 1% добавки B27 и 0,5 мМ GlutaMax, клетки немедленно высевали на стеклянные предметные стекла, покрытые поли-L-лизином (μ-Slide8 Well, Ibidi, каталожный номер 80826), а затем выдерживали при 37°C и 5% CO2 в течение 1 часа для оседания клеток. Визуализацию в реальном времени проводили на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе Leica SP8, оснащенном белым лазером, HyD, объективом 63× [числовая апертура (NA)] с масляной иммерсией и нагревательным столиком.
Мышь быстро анестезировали углекислым газом и обезглавливали, мозг быстро извлекали из черепа и разрезали на сагиттальные срезы толщиной 200 мкм (для эксперимента с мечением 13C) или 275 мкм (для двухфотонных экспериментов), заполненные следующими материалами: мороженое (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Вальдорф, Германия) заполняли следующими веществами: 125 мМ ледяной, насыщенной углеродом (95% O2 и 5% CO2) искусственной цереброспинальной жидкости (ACSF) с низким содержанием Ca2+, NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ фосфатного буфера натрия, 25 мМ NaHCO3, 25 мМ глюкозы, 0,5 мМ CaCl2 и 3,5 мМ MgCl2 (осмотическое давление от 310 до 330 ммоль). Перенесите полученные срезы мозга в камеру предварительной инкубации, содержащую среду ACSF с более высоким содержанием Ca2+ (125,0 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ фосфатного буфера натрия, 25,0 мМ NaHCO3, 25,0 мМ d-глюкозы, 1,0 мМ CaCl2 и 2,0 мМ MgCl2) pH 7,4 и 310–320 ммоль).
В процессе визуализации срезы перемещали в специальную комнату для визуализации, и эксперимент проводили при непрерывной перфузии ACSF при постоянной температуре 32–33 °C. Для визуализации срезов использовали многофотонный лазерный сканирующий микроскоп (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems), оснащенный объективом Leica 25x (NA 0,95, вода), титан-сапфировым лазером (Chameleon Vision II, Coherent) и модулем FLIM (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM Grx1-roGFP2. Изменения цитоплазматического окислительно-восстановительного состояния нейронов ПН измерялись с помощью двухфотонной FLIM в сагиттальных срезах мозга, где биосенсор Grx1-roGFP2 нацелен на нейроны ПН. В слое ПН поле съемки выбиралось примерно на 50–80 мкм ниже поверхности среза, чтобы убедиться в наличии жизнеспособного нейрона ПН (то есть, отсутствии бусинчатой ​​структуры или морфологических изменений нейронов вдоль дендритов), а также двойного положительного сенсора roGFP2 и AAV, кодирующего shRNA PCx или ее контрольную последовательность (каждый из которых совместно экспрессирует mCherry). Получение изображений в один стек с 2-кратным цифровым увеличением [длина волны возбуждения: 890 нм; 512 нм, 512 пикселей]. Для обеспечения сбора достаточного количества фотонов (всего 1000 фотонов) для аппроксимации кривой используется метод обнаружения: внутренний HyD, группа фильтров флуоресцеина изотиоцианата (FITC)] и усреднение изображений в течение 2–3 минут. Чувствительность зонда Grx1-roGFP2 и проверка условий FLIM проводились путем мониторинга значения продолжительности жизни roGFP2 при добавлении экзогенного 10 мМ H2O2 в перфузионную ACSF (для максимизации окисления, что приводит к увеличению продолжительности жизни), а затем при добавлении 2 мМ дитиотреитола (для минимизации степени восстановления, что приводит к уменьшению продолжительности жизни) (Рисунок S8, D–G). Для анализа полученных результатов используйте программное обеспечение FLIMfit 5.1.1, аппроксимируйте кривую экспоненциального затухания всего изображения измеренной функцией отклика прибора (IRF), при этом χ² приблизительно равно 1. Для расчета времени жизни отдельного периферического нерва (ПН) маска вокруг тела нерва была нарисована вручную, и для количественной оценки использовалось среднее время жизни в каждой маске.
Анализ митохондриального потенциала. После инкубации острого участка с 100 нМ TMRM, добавленным непосредственно в перфузируемый ACSF в течение 30 минут, изменения митохондриального потенциала нейронов измеряли с помощью двухфотонного микроскопа. Визуализацию TMRM проводили путем возбуждения зонда при 920 нм и использования внутреннего HyD (тетраметилродамин изотиоцианат: 585/40 нм) для сбора сигналов; для визуализации mtYFP использовали ту же длину волны возбуждения, но другой внутренний HyD (FITC: 525/50). Для оценки митохондриального потенциала на уровне отдельных клеток использовали плагин ImageJ Image Calculator. Вкратце, уравнение плагина: сигнал = мин (mtYFP, TMRM) используется для идентификации области митохондрий, которая показывает сигнал TMRM в нейронах Purkinje Somali на конфокальном изображении одного слоя соответствующего канала. Затем площадь пикселя в полученной маске количественно определяется, а затем нормализуется относительно соответствующего порогового однослойного изображения канала mtYFP для получения митохондриальной фракции, отражающей митохондриальный потенциал.
Изображение было деконволюировано с помощью программного обеспечения Huygens Pro (Scientific Volume Imaging). Для отсканированных изображений плиток был создан монтаж из одной плитки с использованием алгоритма автоматической сшивки, предоставляемого программным обеспечением LAS-X. После калибровки изображения для дальнейшей обработки и равномерной регулировки яркости и контраста использовались ImageJ и Adobe Photoshop. Для графической подготовки использовался Adobe Illustrator.
Анализ очагов мтДНК. Количество повреждений мтДНК было количественно определено на срезах мозжечка, меченных антителами к ДНК, с помощью конфокального микроскопа. Для каждой клетки была создана целевая область, соответствующая ее телу и ядру, и соответствующая площадь была рассчитана с помощью плагина Multi Measure (программное обеспечение ImageJ). Площадь ядра вычиталась из площади тела клетки для получения площади цитоплазмы. Наконец, плагин Analyze Particles (программное обеспечение ImageJ) использовался для автоматического количественного определения точек цитоплазматической ДНК, указывающих на мтДНК на пороговом изображении, и полученные результаты были нормализованы относительно среднего значения PN у мышей CTRL. Результаты выражены как среднее количество нуклеозидов на клетку.
Анализ экспрессии белка. Используйте плагин Image Calculator в ImageJ для оценки экспрессии белка в PN на уровне отдельных клеток. Вкратце, на однослойном конфокальном изображении соответствующего канала, используя уравнение: сигнал = мин (mtYFP, антитело), ​​идентифицируется митохондриальная область, проявляющая иммунореактивность к определенному антителу в Purkina. Затем площадь пикселя в полученной маске количественно определяется, а затем нормализуется по соответствующему пороговому однослойному изображению канала mtYFP для получения митохондриальной доли отображаемого белка.
Анализ плотности клеток Пуркинье. Для оценки плотности клеток Пуркинье использовался плагин Cell Counter в ImageJ. Количество подсчитанных клеток Пуркинье делилось на длину мозжечкового кольца, занимаемого подсчитанными клетками.
Подготовка и сбор образцов. Мозг контрольной группы и мышей Mfn2cKO фиксировали в 2% растворе параформальдегида/2,5% глутаральдегида в 0,1 М фосфатном буфере (ФБ), затем готовили корональные срезы с использованием инфузорий (Leica Mikrosysteme GmbH, Вена, Австрия) (толщина 50–60 мкм). Затем фиксировали в ФБ-буфере с 1% тетраоксидом калия и 1,5% ферроцианидом калия при комнатной температуре в течение 1 часа. Срезы трижды промывали дистиллированной водой, а затем окрашивали 70% этанолом, содержащим 1% ацетата уранила, в течение 20 минут. Затем срезы обезвоживали в спиртах различной концентрации и заливали эпоксидной смолой Durcupan ACM (Araldite casting resin M) (Electron Microscopy Sciences, каталожный номер 14040) между предметными стеклами, покрытыми силиконом, и, наконец, полимеризовали в печи при 60°C в течение 48 часов. Была выбрана область коры мозжечка, и на ней были получены ультратонкие срезы толщиной 50 нм на микроскопе Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Вена, Австрия), которые затем были помещены на медную щелевую сетку размером 2×1 мм, покрытую полистироловой пленкой. Срезы окрашивали раствором 4% ацетата уранила в воде в течение 10 минут, несколько раз промывали водой, затем раствором цитрата свинца Рейнольдса в воде в течение 10 минут, а затем несколько раз промывали водой. Микрофотографии были получены с помощью просвечивающего электронного микроскопа Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США) с использованием цифровой камеры TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Гаутинг, США).
Для мышей, инфицированных AAV, головной мозг отделяли и разрезали на сагиттальные срезы толщиной 1 мм, а мозжечок исследовали с помощью флуоресцентного микроскопа для идентификации кольца, инфицированного AAV (то есть, экспрессирующего mCherry). Использовались только те эксперименты, в которых инъекция AAV приводила к очень высокой эффективности трансдукции слоя клеток Пуркинье (т.е. почти всего слоя) как минимум в двух последовательных кольцах мозжечка. Трансдуцированную AAV петлю микродиссецировали для последующей фиксации в течение ночи (4% параформальдегида и 2,5% глутаральдегида в 0,1 М кокоатном буфере) и далее обрабатывали. Для заливки EPON фиксированную ткань промывали 0,1 М кокоатным буфером натрия (Applichem) и инкубировали с 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) в 0,1 М кокоатном буфере натрия (Applichem) в течение 4 часов, затем промывали в течение 2 часов. Повторите процедуру 3 раза с 0,1 М кокамидным буфером. Затем, используя восходящую серию растворов этанола, инкубируйте каждый раствор при 4°C в течение 15 минут для обезвоживания ткани. Ткань перенесите в пропиленоксид и инкубируйте в течение ночи в EPON (Sigma-Aldrich) при 4°C. Поместите ткань в свежий EPON при комнатной температуре на 2 часа, а затем залейте при 62°C на 72 часа. Используйте ультрамикротом (Leica Microsystems, UC6) и алмазный нож (Diatome, Biel, Швейцария) для получения ультратонких срезов толщиной 70 нм, окрашивайте 1,5% раствором ацетата уранила в течение 15 минут при 37°C, а затем раствором цитрата свинца в течение 4 минут. Электронные микроснимки были получены с помощью просвечивающего электронного микроскопа JEM-2100 Plus (JEOL), оснащенного камерой Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) и программным обеспечением DigitalMicrograph (Gatan). Для анализа электронные микроснимки были получены с цифровым увеличением 5000× или 10000×.
Морфологический анализ митохондрий. Для всех анализов контуры отдельных митохондрий вручную обводились на цифровых изображениях с помощью программного обеспечения ImageJ. Анализировались различные морфологические параметры. Плотность митохондрий выражалась в процентах, полученных путем деления общей площади митохондрий каждой клетки на площадь цитоплазмы (площадь цитоплазмы = площадь клетки - площадь ядра клетки) × 100. Округлость митохондрий рассчитывалась по формуле [4π∙(площадь/периметр²)]. Морфология митохондрий анализировалась и делилась на две категории («трубчатые» и «пузырчатые») в соответствии с их основной формой.
Анализ количества и плотности аутофагосом/лизосом. Используйте программное обеспечение ImageJ для ручного обведения контуров каждой аутофагосомы/лизосомы на цифровом изображении. Площадь аутофагосом/лизосом выражается в процентах и ​​рассчитывается путем деления общей площади аутофагосом/лизосомных структур каждой клетки на площадь цитоплазмы (площадь цитоплазмы = площадь клетки - площадь ядра) × 100. Плотность аутофагосом/лизосом рассчитывается путем деления общего количества на количество аутофагосом/лизосомных структур на клетку (в пересчете на площадь цитоплазмы) (площадь цитоплазмы = площадь клетки - площадь ядра).
Мечение для получения острых срезов и подготовки образцов. Для экспериментов, требующих мечения глюкозой, перенесите острые срезы мозга в камеру предварительной инкубации, содержащую насыщенный углерод (95% O2 и 5% CO2), высококальциевый раствор ACSF (125,0 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ фосфатного буфера натрия, 25,0 мМ NaHCO3, 25,0 мМ d-глюкозы, 1,0 мМ CaCl2 и 2,0 мМ MgCl2, pH 7,4 и осмолярность 310–320 мОсм), в котором глюкоза представляет собой 13C6-замещение глюкозы (Eurisotop, каталожный номер CLM-1396). Для экспериментов, требующих мечения пируватом, перенесите острые срезы мозга в раствор ACSF с более высоким содержанием Ca2+ (125,0 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ фосфатного буфера натрия, 25,0 мМ NaHCO3, 25,0 мМ d-глюкозы, 1,0 мМ CaCl2 и добавьте 2,0 мМ MgCl2, отрегулируйте pH до 7,4 и осмолярность от 310 до 320 мОсм) и добавьте 1 мМ 1-[1-13C]пирувата (Eurisotop, каталожный номер CLM-1082). Инкубируйте срезы в течение 90 минут при 37°C. В конце эксперимента срезы быстро промывали водным раствором (pH 7,4), содержащим 75 мМ карбоната аммония, а затем гомогенизировали в смеси ацетонитрила (ACN) метанола и воды в соотношении 40:40:20 (об/об/об). После инкубации срезов на льду в течение 30 минут образцы центрифугировали при 21 000 g в течение 10 минут при 4°C, а прозрачный супернатант высушивали в концентраторе SpeedVac. Полученный высушенный осадок метаболитов хранили при -80°C до анализа.
Анализ 13C-меченых аминокислот методом жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии. Для анализа методом жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ЖХ-МС) осадок метаболита ресуспендировали в 75 мкл воды для ЖХ-МС (Honeywell). После центрифугирования при 21 000 g в течение 5 минут при 4°C 20 мкл осветленного супернатанта использовали для анализа потока аминокислот, а остальную часть экстракта немедленно использовали для анализа анионов (см. ниже). Анализ аминокислот проводили с использованием ранее описанного протокола дериватизации бензоилхлоридом (55, 56). На первом этапе к 20 мкл экстракта метаболита добавляли 10 мкл 100 мМ карбоната натрия (Sigma-Aldrich), а затем к ацетонитрилу для ЖХ добавляли 10 мкл 2% бензоилхлорида (Sigma-Aldrich). Образец кратковременно перемешивали на вихревом смесителе, а затем центрифугировали при 21 000 g в течение 5 минут при 20°C. Осветленный супернатант переносили в автосамплерный флакон объемом 2 мл с конической стеклянной вставкой (объемом 200 мкл). Образцы анализировали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии Acquity iClass (Waters), подключенной к высокоразрешающему прецизионному масс-спектрометру Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) (Thermo Fisher Scientific). Для анализа 2 мкл дериватизированного образца вводили в колонку с высокопрочным силикагелем T3 размером 100×1,0 мм (Waters), содержащую частицы размером 1,8 мкм. Скорость потока составляла 100 мкл/мин, а буферная система состояла из буфера А (10 мМ формиата аммония и 0,15% муравьиной кислоты в воде) и буфера В (ацетонитрил). Градиент следующий: 0% B в 0 минут; 0% B; от 0 до 15% B в 0–0,1 минуты; от 15 до 17% B в 0,1–0,5 минуты; B от 17 до 55% в 0,5–14 минут; B от 55 до 70% в 14–14,5 минуты; от 14,5 до 70 до 100% B в 18 минут; 100% B в 18–19 минут; от 100 до 0% B в 19–19,1 минуты; 0% B в 19,1–28 минут (55, 56). Масс-спектрометр QE-HF работает в режиме положительной ионизации с диапазоном масс m/z (отношение массы к заряду) от 50 до 750. Применяемое разрешение составляет 60 000, целевое значение ионизации с регулированием усиления (AGC) — 3×10⁶, а максимальное время ионизации — 100 миллисекунд. Нагреваемый источник электроспрейной ионизации (ESI) работает при напряжении распыления 3,5 кВ, температуре капилляра 250°C, потоке воздуха в защитной оболочке 60 AU (условных единиц) и вспомогательном потоке воздуха 20 AU. При температуре 250°C линза S установлена ​​на 60 AU.
Анализ меченых 13C органических кислот методом анионной хроматографии-масс-спектрометрии. Оставшийся осадок метаболита (55 мкл) анализировали с помощью системы ионной хроматографии Dionex (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific), подключенной к масс-спектрометру QE-HF (Thermo Fisher Scientific). Вкратце, 5 мкл экстракта метаболита вводили в колонку Dionex IonPac AS11-HC, оснащенную системой ВЭЖХ (2 мм × 250 мм, размер частиц 4 мкм, Thermo Fisher Scientific), в режиме частичной петли с коэффициентом заполнения 1. Также использовали защитную колонку Dionex IonPac AG11-HC (2 мм × 50 мм, 4 мкм, Thermo Fisher Scientific). Температуру колонки поддерживали на уровне 30 °C, а автосамплер — на уровне 6 °C. Для создания градиента гидроксида калия через генератор элюента использовали картридж с гидроксидом калия, снабженный деионизированной водой. Разделение метаболитов проводилось при скорости потока 380 мкл/мин с применением следующего градиента: от 0 до 3 минут, 10 мМ KOH; от 3 до 12 минут, от 10 до 50 мМ KOH; от 12 до 19 минут, от 50 до 100 мМ KOH; от 19 до 21 минуты, 100 мМ KOH; от 21 до 21,5 минут, от 100 до 10 мМ KOH. Колонка была повторно уравновешена в 10 мМ KOH в течение 8,5 минут.
Элюированные метаболиты после колонки смешиваются с дополнительным потоком изопропанола со скоростью 150 мкл/мин, а затем направляются в масс-спектрометр высокого разрешения, работающий в режиме отрицательной ионизации. Масс-спектрометр отслеживает диапазон масс от m/z 50 до 750 с разрешением 60 000. Автоматическая регулировка усиления (AGC) установлена ​​на 1×10⁶, а максимальное время ионизации составляет 100 мс. Нагреваемый источник ESI работал при напряжении распыления 3,5 кВ. Другие настройки источника ионов следующие: температура капилляра 275 °C; поток газа-носителя 60 AU; поток вспомогательного газа 20 AU при 300 °C, и настройка линзы S на 60 AU.
Анализ данных по меченым изотопом 13C метаболитам. Для анализа изотопных соотношений использовалось программное обеспечение TraceFinder (версия 4.2, Thermo Fisher Scientific). Идентичность каждого соединения была подтверждена надежным эталонным соединением и независимо проанализирована. Для проведения анализа изотопного обогащения площадь хроматограммы экстрагированного иона (XIC) каждого изотопа 13C (Mn) была извлечена из [M + H]+, где n — число атомов углерода целевого соединения, используемого для анализа аминокислот, или [MH]+, используемого для анализа анионов. Точность измерения массы XIC составляет менее пяти частей на миллион, а точность измерения времени удерживания (RT) — 0,05 минуты. Анализ обогащения проводился путем вычисления отношения каждого обнаруженного изотопа к сумме всех изотопов соответствующего соединения. Эти соотношения представлены в виде процентных значений для каждого изотопа, а результаты выражены в виде молярного процентного обогащения (MPE), как описано ранее (42).
Замороженный нейронный осадок гомогенизировали в ледяном 80% метаноле (об/об), перемешивали на вихревом смесителе и инкубировали при -20°C в течение 30 минут. Образец снова перемешивали на вихревом смесителе и перемешивали при +4°C в течение 30 минут. Образец центрифугировали при 21 000 g в течение 5 минут при 4°C, затем полученный супернатант собирали и высушивали с помощью концентратора SpeedVac при 25°C для последующего анализа. Как описано выше, анализ LC-MS проводили на аминокислотах отсортированных клеток. С помощью TraceFinder (версия 4.2, Thermo Fisher Scientific) анализ данных проводили с использованием моноизотопной массы каждого соединения. Квантильную нормализацию данных метаболитов проводили с помощью программного пакета preprocessCore (57).
Подготовка срезов. Мышь быстро анестезировали углекислым газом и обезглавливали, мозг быстро извлекали из черепа, и с помощью вибрационного ножа, заполненного льдом (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Вальдорф, Германия), разрезали его на сагиттальные срезы толщиной 300–375 мкм. Холодная газификация углерода (95% O2 и 5% CO2). Низкое содержание Ca2+ в ACSF (125,0 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ фосфатный буфер натрия, 25,0 мМ NaHCO3, 25,0 мМ d-глюкоза, 1,0 мМ CaCl2 и 6,0 мМ MgCl2). Доведение pH до 7,4 и осмолярности до 310–330 мОсм). Перенесите полученные срезы мозга в камеру с более высокой концентрацией Ca2+ в растворе ACSF (125,0 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ фосфатного буфера натрия, 25,0 мМ NaHCO3, 25,0 мМ d-глюкозы, 4,0 мМ CaCl2 и 3,5 мМ MgCl2), pH 7,4 и осмолярностью 310–320 мОсм. Выдержите срезы в течение 20–30 минут для восстановления перед записью.
Запись. Для всех записей использовался микроскопный столик, оснащенный фиксированной камерой для записи и 20-кратным объективом с водной иммерсией (Scientifica). Предполагаемые клетки Пуркинье идентифицировались по (i) размеру тела, (ii) анатомическому расположению мозжечка и (iii) экспрессии флуоресцентного репортерного гена mtYFP. Патч-пипетка с сопротивлением кончика от 5 до 11 мегаом вытягивалась с помощью боросиликатного стеклянного капилляра (GB150-10, 0,86 мм × 1,5 мм × 100 мм, Science Products, Хофхайм, Германия) и горизонтальной пипетки Instruments (P-1000, Sutter, Новато, Калифорния). Все записи выполнялись с помощью усилителя для патч-клемпа ELC-03XS npi (npi electronic GmbH, Там, Германия), управляемого программным обеспечением Signal (версия 6.0, Cambridge Electronic, Кембридж, Великобритания). Эксперимент записывался с частотой дискретизации 12,5 кГц. Сигнал фильтровался двумя коротковолновыми фильтрами Бесселя с частотами среза 1,3 и 10 кГц соответственно. Емкость мембраны и пипетки компенсировалась компенсационной схемой с использованием усилителя. Все эксперименты проводились под управлением камеры Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Герден, Германия), которая управлялась программным обеспечением Hokawo (версия 2.8, Hamamatsu, Герден, Германия).
Стандартная конфигурация и анализ целых клеток. Непосредственно перед записью заполните пипетку внутренним раствором, содержащим следующие вещества: 4,0 мМ KCl, 2,0 мМ NaCl, 0,2 мМ EGTA, 135,0 мМ глюконата калия, 10,0 мМ Hepes, 4,0 мМ АТФ (Mg), 0,5 мМ гуанозинтрифосфата (ГТФ) (Na) и 10,0 мМ креатинфосфата, доведенным до pH 7,25, а осмотическое давление составляло 290 мОсм (сахароза). Сразу после приложения силы 0 пА для разрыва мембраны измеряли потенциал покоя мембраны. Входное сопротивление измеряли путем приложения гиперполяризованных токов -40, -30, -20 и -10 пА. Измерьте величину вольтажного ответа и используйте закон Ома для расчета входного сопротивления. Спонтанная активность регистрировалась в режиме фиксации напряжения в течение 5 минут, а sPSC идентифицировались и измерялись в Igor Pro (версия 32 7.01, WaveMetrics, Лейк-Освего, Орегон, США) с использованием полуавтоматического скрипта распознавания. Вольт-амперная характеристика и стационарный ток измерялись путем фиксации напряжения батареи при различных потенциалах (начиная с -110 мВ) и увеличения напряжения с шагом 5 мВ. Генерация потенциала действия (ПД) проверялась путем приложения деполяризующего тока. Клетка фиксировалась при -70 мВ при одновременном приложении импульса деполяризующего тока. Шаг изменения напряжения для каждого регистрирующего блока регулировался отдельно (от 10 до 60 пА). Максимальная частота ПД рассчитывалась путем ручного подсчета импульсных всплесков, вызывающих самую высокую частоту ПД. Порог ПД анализировался с использованием второй производной деполяризующего импульса, который первым запускает один или несколько ПД.
Конфигурация и анализ перфорированного патча. Выполните запись с помощью перфорированного патча, используя стандартные протоколы. Используйте пипетку, не содержащую АТФ и ГТФ, в составе которой отсутствуют следующие компоненты: 128 мМ глюконата калия, 10 мМ KCl, 10 мМ Hepes, 0,1 мМ EGTA и 2 мМ MgCl2, и отрегулируйте pH до 7,2 (с помощью KOH). АТФ и ГТФ исключаются из внутриклеточного раствора, чтобы предотвратить неконтролируемую проницаемость клеточной мембраны. Пипетку для записи патча заполняют внутренним раствором, содержащим амфотерицин (приблизительно 200–250 мкг/мл; G4888, Sigma-Aldrich), для получения записи с перфорированным патчем. Амфотерицин растворяли в диметилсульфоксиде (конечная концентрация: 0,1–0,3%; ДМСО; D8418, Sigma-Aldrich). Используемая концентрация ДМСО не оказывала существенного влияния на исследуемые нейроны. В процессе пробивания непрерывно контролировалось сопротивление канала (Ra), и эксперимент начинался после стабилизации амплитуды Ra и потенциала действия (ПД) (20-40 минут). Спонтанная активность измерялась в режиме фиксации напряжения и/или тока в течение 2-5 минут. Анализ данных проводился с использованием Igor Pro (версия 7.05.2, WaveMetrics, США), Excel (версия 2010, Microsoft Corporation, Редмонд, США) и GraphPad Prism (версия 8.1.2, GraphPad Software Inc., Ла-Холья, Калифорния, США). Для идентификации спонтанных ПД использовался плагин NeuroMatic v3.0c от IgorPro. Автоматическая идентификация ПД осуществляется с использованием заданного порогового значения, которое настраивается индивидуально для каждой записи. Используя интервал между спайками, определяется частота спайков с максимальной мгновенной частотой спайков и средней частотой спайков.
Выделение ПН. Адаптируя ранее опубликованный протокол, ПН были очищены из мозжечка мыши на определенной стадии (58). Вкратце, мозжечок был выделен и измельчен в ледяной диссоциационной среде [без HBSS, Ca2+ и Mg2+, с добавлением 20 мМ глюкозы, пенициллина (50 Ед/мл) и стрептомицина (0,05 мг/мл)], а затем среда была обработана папаином [HBSS, с добавлением 1-цистеина·HCl (1 мг/мл), папаина (16 Ед/мл) и дезоксирибонуклеазы I (ДНКазы I; 0,1 мг/мл)] в течение 30 минут при 30°C. Сначала ткани промывали в среде HBSS, содержащей яичную слизь (10 мг/мл), BSA (10 мг/мл) и ДНКазу (0,1 мг/мл), при комнатной температуре для предотвращения ферментативного расщепления, а затем в среде HBSS, содержащей 20 мМ глюкозы. Осторожное измельчение в HBSS с добавлением пенициллина (50 Ед/мл), стрептомицина (0,05 мг/мл) и ДНКазы (0,1 мг/мл) высвобождало отдельные клетки. Полученную клеточную суспензию фильтровали через клеточный фильтр с размером пор 70 мкм, затем клетки осаждали центрифугированием (1110 об/мин, 5 минут, 4°C) и ресуспендировали в сортировочной среде [HBSS, дополненной 20 мМ глюкозы, 20% фетальной бычьей сыворотки, пенициллином (50 Ед/мл) и стрептомицином (0,05 мг/мл)]; Оценить жизнеспособность клеток с помощью пропидиум йодида и отрегулировать плотность клеток до 1×10⁶–2×10⁶ клеток/мл. Перед проточной цитометрией суспензию фильтровали через клеточный фильтр с размером пор 50 мкм.
Проточный цитометр. Сортировка клеток проводилась при 4°C с использованием прибора FACSAria III (BD Biosciences) и программного обеспечения FACSDiva (BD Biosciences, версия 8.0.1). Клеточная суспензия сортировалась с помощью сопла диаметром 100 мкм под давлением 20 psi со скоростью ~2800 событий/сек. Поскольку традиционные критерии гейтирования (размер клетки, бимодальная дискриминация и характеристики рассеяния) не могут гарантировать правильную изоляцию PN от других типов клеток, стратегия гейтирования устанавливается на основе прямого сравнения интенсивности YFP и автофлуоресценции у мышей mitoYFP+ ​​и контрольных мышей mitoYFP−. YFP возбуждается путем облучения образца лазерной линией 488 нм, а сигнал детектируется с помощью полосового фильтра 530/30 нм. У мышей mitoYFP+ ​​относительная сила репортерного гена Rosa26-mitoYFP также используется для различения фрагментов нейрональных тел и аксонов. 7-AAD возбуждается желтым лазером с длиной волны 561 нм и детектируется полосовым фильтром 675/20 нм для исключения мертвых клеток. Для одновременного разделения астроцитов клеточная суспензия окрашивается ACSA-2-APC, затем образец облучается лазерной линией с длиной волны 640 нм, а для детектирования сигнала используется полосовой фильтр 660/20 нм.
Собранные клетки осаждали центрифугированием (1110 об/мин, 5 минут, 4°C) и хранили при -80°C до использования. Мышей Mfn2cKO и их потомство классифицировали в один и тот же день, чтобы минимизировать вариабельность процедуры. Представление и анализ данных FACS проводили с помощью программного обеспечения FlowJo (FlowJo LLC, Ашленд, Орегон, США).
Как упоминалось выше (59), ПЦР в реальном времени используется для выделения ДНК из отсортированных нейронов для последующего количественного определения мтДНК. Линейность и пороговая чувствительность были первоначально проверены путем проведения qPCR на различном количестве клеток. Вкратце, 300 ПН собирали в лизисный буфер, состоящий из 50 мМ трис-HCl (pH 8,5), 1 мМ ЭДТА, 0,5% Твин 20 и протеиназы К (200 нг/мл), и инкубировали при 55°C в течение 120 минут. Затем клетки дополнительно инкубировали при 95°C в течение 10 минут для обеспечения полной инактивации протеиназы К. Используя зонд TaqMan (Thermo Fisher), специфичный для мт-Nd1, мтДНК измеряли полуколичественной ПЦР в системе ПЦР в реальном времени 7900HT (Thermo Fisher Scientific). Гены mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, каталожный номер Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, каталожный номер AIVI3E8) и 18S (Thermo Fisher Scientific, каталожный номер Hs99999901_s1).
Подготовка образца протеома. Раствор нагревали при 95°C в течение 10 минут и подвергали ультразвуковой обработке в лизисном буфере [6 М хлорид гуанидина, 10 мМ гидрохлорид трис(2-карбоксиэтил)фосфина, 10 мМ хлорацетамид и 100 мМ трис-HCl]. Лизис проводили на приборе Bioruptor (Diagenode) в течение 10 минут (30 секунд импульса / 30 секунд паузы). Образец разбавляли в соотношении 1:10 в 20 мМ трис-HCl (pH 8,0), смешивали с 300 нг трипсина золота (Promega) и инкубировали в течение ночи при 37°C для полного переваривания. На второй день образец центрифугировали при 20 000 g в течение 20 минут. Надосадочную жидкость разбавляли 0,1% муравьиной кислотой, а раствор обессоливали с помощью изготовленных самостоятельно StageTips. Образец высушивали в приборе SpeedVac (концентратор Eppendorf plus 5305) при 45°C, после чего пептид суспендировали в 0,1% муравьиной кислоте. Все образцы готовили одновременно одним и тем же человеком. Для анализа образцов астроцитов 4 мкг обессоленных пептидов метили тандемным масс-меткой (TMT10plex, каталожный номер 90110, Thermo Fisher Scientific) в соотношении пептид к реагенту TMT 1:20. Для мечения TMT 0,8 мг реагента TMT ресуспендировали в 70 мкл безводного ацетонитрила (ACN), а высушенный пептид растворяли в 9 мкл 0,1 М TEAB (триэтиламмонийбикарбоната), к которому добавляли 7 мкл реагента TMT в ACN. Концентрация составляла 43,75%. После 60 минут инкубации реакцию останавливали добавлением 2 мкл 5% гидроксиламина. Меченые пептиды собирали, высушивали, ресуспендировали в 200 мкл 0,1% муравьиной кислоты (FA), разделяли на две части, а затем обессоливали с помощью самодельных StageTips. С помощью высокоэффективного жидкостного хроматографа UltiMate 3000 (UltiMate 3000 ultra high performance liquid chromatograph) одну из двух половин фракционировали на хроматографической колонке Acquity размером 1 мм x 150 мм, заполненной частицами C18 размером 1,7 мкм и длиной 130 Å (Waters, каталожный номер SKU: 186006935). Thermo Fisher Scientific). Разделение пептидов проводили со скоростью потока 30 мкл/мин, разделение от 1% до 50% буфера B в течение 85 минут с пошаговым градиентом в течение 96 минут, от 50% до 95% буфера B в течение 3 минут, затем 8 минут для 95% буфера B; буфер A представляет собой 5% ацетонитрила (ACN) и 10 мМ бикарбоната аммония (ABC), а буфер B — 80% ацетонитрила и 10 мМ ABC. Собирайте фракции каждые 3 минуты, объединяйте их в две группы (1 + 17, 2 + 18 и т. д.) и высушивайте в вакуумной центрифуге.
LC-MS/MS анализ. Для масс-спектрометрии пептиды (номер r119.aq) разделяли на аналитической колонке PicoFrit длиной 25 см и внутренним диаметром 75 мкм (новый объектив, артикул PF7508250), оснащенной средой ReproSil-Pur 120 C18-AQ 1,9 мкм (Dr. Maisch, mat), используя EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Германия). Колонку поддерживали при температуре 50°C. Буферы A и B представляли собой 0,1% муравьиную кислоту в воде и 0,1% муравьиную кислоту в 80% ацетонитриле соответственно. Разделение пептидов проводили в буфере B в течение 65 минут при концентрации от 6% до 31% и в буфере B в течение 5 минут при градиенте 200 нл/мин. Элюированные пептиды анализировались на масс-спектрометре Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific). Измерение m/z предшественника пептида проводилось с разрешением 120 000 в диапазоне от 350 до 1500 m/z. Используя 27%-ную нормированную энергию столкновения, для высокоэнергетического расщепления в ловушке C (HCD) выбирался наиболее сильный предшественник с зарядом от 2 до 6. Время цикла устанавливалось на 1 с. Значение m/z фрагмента пептида измерялось в ионной ловушке с использованием наименьшей целевой величины AGC 5×10⁴ и максимального времени инжекции 86 мс. После фрагментации предшественник помещался в список динамического исключения на 45 с. TMT-меченые пептиды разделяли на колонке Acclaim PepMap длиной 50 см и размером пор 75 мкм (Thermo Fisher Scientific, каталожный номер 164942), а спектры миграции анализировали на масс-спектрометре Orbitrap Lumos Tribrid (Thermo Fisher Scientific), оснащенном оборудованием для высокопольной асимметричной ионной масс-спектрометрии (FAIMS) (Thermo Fisher Scientific), работающем при двух компенсационных напряжениях −50 и −70 В. Для измерения сигнала ионов TMT использовали MS3, выбранный на основе синхронизирующего прекурсора. Разделение пептидов проводили на EASY-nLC 1200 с использованием 90% линейного градиентного элюирования с концентрацией буфера от 6% до 31%; буфер А содержал 0,1% муравьиной кислоты, а буфер В — 0,1% муравьиной кислоты и 80% ацетонитрила. Аналитическая колонка работала при температуре 50°C. Используйте FreeStyle (версия 1.6, Thermo Fisher Scientific) для разделения исходного файла в соответствии с напряжением компенсации FAIMS.
Идентификация и количественное определение белков. Исходные данные анализировались с помощью встроенной поисковой системы Andromeda, используя MaxQuant версии 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). В дополнение к последовательностям Cre-рекомбиназы и YFP, полученным из Aequorea victoria, проводился поиск по спектрам пептидных фрагментов канонической последовательности и изоформы референсного протеома мыши (идентификатор протеома UP000000589, загружен из UniProt в мае 2017 г.). Окисление метионина и N-концевое ацетилирование белка были установлены в качестве вариабельных модификаций; карбамоилметилирование цистеина было установлено в качестве фиксированных модификаций. Параметры расщепления установлены на «специфичность» и «трипсин/P». Минимальное количество пептидов и пептидов Razor, используемых для идентификации белков, составляет 1; Минимальное количество уникальных пептидов равно 0. В условиях сопоставления пептидных карт скорость идентификации белка составила 0,01. Опция «Второй пептид» включена. Используйте опцию «сопоставление между запусками» для переноса успешных идентификаций между различными исходными файлами. Используйте минимальное значение коэффициента LFQ, равное 1, для количественной оценки без меток (LFQ) (60). Интенсивность LFQ фильтруется как минимум по двум допустимым значениям как минимум в одной группе генотипов в каждой временной точке и экстраполируется из нормального распределения с шириной 0,3 и сдвигом вниз 1,8. Для анализа результатов LFQ используйте вычислительную платформу Perseus (https://maxquant.net/perseus/) и R (https://r-project.org/). Для анализа дифференциальной экспрессии использовался двухсторонний t-тест средней сложности из программного пакета limma (61). Предварительный анализ данных проводился с использованием ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally и pheatmap. Протеомные данные на основе TMT анализировались с помощью MaxQuant версии 1.6.10.43. Поиск исходных протеомных данных проводился в базе данных протеомики человека UniProt, загруженной в сентябре 2018 года. Анализ включает поправочный коэффициент чистоты изотопов, предоставленный производителем. Для анализа дифференциальной экспрессии использовалась библиотека limma в R. Исходные данные, результаты поиска в базе данных, а также алгоритм анализа данных и его результаты хранятся в альянсе ProteomeXchange через партнерский репозиторий PRIDE с идентификатором набора данных PXD019690.
Функциональные аннотации обогащают анализ. Для определения богатства терминов функциональной аннотации набора данных через 8 недель использовался инструмент Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) (Рисунок 1). Вкратце, количественный список белков, полученный в результате анализа данных LC-MS/MS (тандемная масс-спектрометрия), используется со следующими критериями фильтрации: Mus musculus выбран в качестве вида и фонового значения, а категория, в которой значение P, скорректированное Бенджамини для обогащения, равное 0,05 или ниже, считается значимой. На этом графике показаны пять категорий с наибольшим избытком в каждом кластере на основе скорректированного значения P. С помощью множественного t-теста, используя двухэтапную линейную программу бустинга Бенджамини, Кригера и Екутиели (Q = 5%), проводится анализ экспрессии белков во времени для важных кандидатов, выявленных в каждой категории, и каждая строка анализируется отдельно. Нет необходимости использовать согласованное стандартное отклонение.
Чтобы сравнить результаты этого исследования с опубликованными базами данных и создать диаграмму Венна на рисунке 1, мы объединили количественный список белков с аннотациями MitoCarta 2.0 (24). Используйте онлайн-инструмент «Нарисовать диаграмму Венна» (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) для создания диаграммы.
Подробную информацию о статистических процедурах, использованных для протеомного анализа, см. в соответствующем разделе «Материалы и методы». Подробная информация обо всех остальных экспериментах приведена в соответствующей легенде. Если не указано иное, все данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (SEM), а все статистические анализы проводились с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 8.1.2.
Дополнительные материалы к этой статье можно найти по адресу http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution-Non-Commercial, которая разрешает использование, распространение и воспроизведение в любом формате при условии, что конечное использование не преследует коммерческой выгоды и что оригинальная работа является корректной. Ссылка.
Примечание: Мы просим вас указать адрес электронной почты только для того, чтобы человек, которого вы рекомендуете этой странице, знал, что вы хотите, чтобы он увидел это письмо, и что это не спам. Мы не будем собирать адреса электронной почты.
Этот вопрос используется для проверки того, являетесь ли вы посетителем, и предотвращения автоматической отправки спама.
Э. Мотори, И. Атанасов, С.М.В. Кочан, К. Фольц-Донахью, В. Сактивелу, П. Джавалиско, Н. Тони, Ж. Пуял, Н.-Г. Ларсон
Протеомный анализ дисфункциональных нейронов показал, что для противодействия нейродегенерации активируются метаболические программы.
Э. Мотори, И. Атанасов, С.М.В. Кочан, К. Фольц-Донахью, В. Сактивелу, П. Джавалиско, Н. Тони, Ж. Пуял, Н.-Г. Ларсон
Протеомный анализ дисфункциональных нейронов показал, что для противодействия нейродегенерации активируются метаболические программы.
©2020 Американская ассоциация содействия развитию науки. все права защищены. AAAS является партнером HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef и COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.