Спасибо за посещение сайта Nature.com. Версия используемого вами браузера имеет ограниченную поддержку CSS. Для достижения наилучших результатов мы рекомендуем использовать более новую версию вашего браузера (или отключить режим совместимости в Internet Explorer). В настоящее время, для обеспечения дальнейшей поддержки, мы отображаем сайт без стилей и JavaScript.
Ранняя диагностика эссенциального тремора (ЭТ) может быть сложной задачей, особенно при дифференциации от здоровых людей (ЗЛ) и болезни Паркинсона (БП). В последнее время анализ образцов стула на наличие кишечной микробиоты и ее метаболитов предоставил новые методы для обнаружения новых биомаркеров нейродегенеративных заболеваний. Короткоцепочечные жирные кислоты (КЖК), как основной метаболит кишечной флоры, снижены в кале при БП. Однако фекальные КЖК никогда не изучались при ЭТ. Мы поставили перед собой цель исследовать фекальные уровни КЖК при ЭТ, оценить их связь с клиническими симптомами и кишечной микробиотой, а также определить их потенциальную диагностическую ценность. Фекальные КЖК и кишечная микробиота были измерены у 37 пациентов с ЭТ, 37 пациентов с впервые выявленной БП и 35 ЗЛ. Запор, вегетативная дисфункция и тяжесть тремора оценивались с помощью шкал. Фекальные уровни пропионата, бутирата и изобутирата были ниже у пациентов с ЭТ, чем у ЗЛ. Сочетание пропионовой, масляной и изомасляной кислот позволило отличить эссенциальный тремор (ЭТ) от здорового человека (ЗНС) с AUC 0,751 (95% ДИ: 0,634–0,867). Уровни изовалериановой и изомасляной кислот в кале были ниже при ЭТ, чем при болезни Паркинсона (БП). Изовалериановая и изомасляная кислоты позволяют дифференцировать ЭТ и БП с AUC 0,743 (95% ДИ: 0,629–0,857). Фекальный пропионат обратно коррелирует с запорами и вегетативной дисфункцией. Изомасляная и изовалериановая кислоты обратно коррелируют с тяжестью тремора. Снижение содержания короткоцепочечных жирных кислот (КЖК) в кале было связано со снижением численности Faecalibacterium и Streptobacterium при ЭТ. Таким образом, содержание КЖК в кале снижается при ЭТ и связано с тяжестью клинической картины и изменениями кишечной микробиоты. Фекальные пропионат, бутират, изобутират и изовалерат могут быть потенциальными диагностическими и дифференциально-диагностическими биомаркерами эссенциальной тромбоцитемии.
Эссенциальный тремор (ЭТ) — это прогрессирующее хроническое нейродегенеративное заболевание, характеризующееся прежде всего тремором верхних конечностей, который также может поражать другие части тела, такие как голова, голосовые связки и нижние конечности¹. Клинические проявления ЭТ включают не только двигательные симптомы, но и некоторые немоторные признаки, в том числе заболевания желудочно-кишечного тракта². Было проведено множество исследований для изучения патологических и физиологических характеристик эссенциального тремора, но четкие патофизиологические механизмы до сих пор не установлены³,⁴; Недавние исследования предполагают, что дисфункция оси микробиота-кишечник-мозг может способствовать развитию нейродегенеративных заболеваний, и появляется все больше доказательств потенциальной двусторонней связи между кишечной микробиотой и нейродегенеративными заболеваниями⁵,⁶. Примечательно, что в одном случае трансплантация фекальной микробиоты улучшила как эссенциальный тремор, так и синдром раздраженного кишечника у пациента, что может указывать на тесную связь между кишечной микробиотой и эссенциальным тремором. Кроме того, мы также обнаружили специфические изменения в кишечной микробиоте у пациентов с ЭТ, что убедительно подтверждает важную роль кишечного дисбиоза при ЭТ8.
Что касается дисбиоза кишечника при нейродегенеративных заболеваниях, то болезнь Паркинсона (БП) является наиболее изученным заболеванием⁵. Несбалансированная микробиота может повышать проницаемость кишечника и активировать кишечные глиальные клетки, что приводит к альфа-синуклеинопатиям⁹,¹⁰,¹¹. БП и эссенциальный тремор (ЭТ) имеют некоторые общие черты, такие как схожая частота тремора у пациентов с ЭТ и БП, перекрывающиеся треморы покоя (типичный тремор при БП) и постуральный тремор (в основном встречающийся у пациентов с ЭТ), что затрудняет их дифференциацию на ранних стадиях¹². Поэтому нам срочно необходимо открыть полезный инструмент для дифференциации ЭТ и БП. В этом контексте изучение специфического дисбиоза кишечника и связанных с ним изменений метаболитов при ЭТ, а также выявление их отличий от БП может стать потенциальным биомаркером для диагностики и дифференциальной диагностики ЭТ.
Короткоцепочечные жирные кислоты (КЖК) являются основными метаболитами, образующимися в результате бактериальной ферментации пищевых волокон в кишечнике, и, как считается, играют критическую роль во взаимодействии кишечника и головного мозга13,14. КЖК поглощаются клетками толстой кишки и транспортируются в печень через портальную венозную систему, а некоторые КЖК попадают в системный кровоток. КЖК оказывают местное воздействие на поддержание целостности кишечного барьера и стимулируют врожденный иммунитет в слизистой оболочке кишечника15. Они также оказывают долгосрочное воздействие на гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), стимулируя белки плотных соединений и активируя нейроны путем стимуляции G-белковых рецепторов (GPCR) для пересечения ГЭБ16. Ацетат, пропионат и бутират являются наиболее распространенными КЖК в толстой кишке. Предыдущие исследования показали снижение уровня уксусной, пропионовой и масляной кислот в кале у пациентов с болезнью Паркинсона17. Однако уровень короткоцепочечных жирных кислот в кале у пациентов с эссенциальной тромбоцитемией никогда не изучался.
Таким образом, целью нашего исследования было выявление специфических изменений в фекальных короткоцепочечных жирных кислотах (КЦЖК) у пациентов с эссенциальным тремором (ЭТ) и их отличий от пациентов с болезнью Паркинсона (БП), оценка взаимосвязи фекальных КЦЖК с клиническими симптомами ЭТ и кишечной микробиотой, а также определение потенциальных диагностических и дифференциально-диагностических возможностей образцов кала. КЖК. Для учета факторов, влияющих на результаты, связанных с противопаркинсоническими препаратами, в качестве контрольной группы были выбраны пациенты с впервые выявленной болезнью Паркинсона.
Демографические и клинические характеристики 37 пациентов с ЭТ, 37 пациентов с БП и 35 здоровых контрольных лиц представлены в таблице 1. Пациенты с ЭТ, БП и здоровые контрольные лица были подобраны по возрасту, полу и ИМТ. В трех группах также наблюдались схожие показатели курения, употребления алкоголя, кофе и чая. Оценка по шкале Векснера (P = 0,004) и оценка по шкале HAMD-17 (P = 0,001) в группе БП были выше, чем в группе здоровых контрольных лиц, а оценки по шкале HAMA (P = 0,011) и HAMD-17 (P = 0,011) в группе ЭТ были выше, чем в группе здоровых контрольных лиц. Продолжительность заболевания в группе ЭТ была значительно больше, чем в группе БП (P < 0,001).
Были выявлены значительные различия в уровнях фекальной пропионовой кислоты (P = 0,023), уксусной кислоты (P = 0,039), масляной кислоты (P = 0,020), изовалериановой кислоты (P = 0,045) и изомасляной кислоты (P = 0,015). При дальнейшем апостериорном анализе уровни пропионовой кислоты (P = 0,023), масляной кислоты (P = 0,007) и изомасляной кислоты (P = 0,040) в группе ЭТ были значительно ниже, чем в группе ГК. У пациентов с ЭТ уровни изовалерата (P = 0,014) и изомасляной кислоты (P = 0,005) были ниже, чем у пациентов с ПД. Кроме того, уровни пропионовой кислоты (P = 0,013), уксусной кислоты (P = 0,016) и масляной кислоты (P = 0,041) в кале были ниже у пациентов с болезнью Паркинсона, чем у пациентов с хроническим колитом (рис. 1 и дополнительная таблица 1).
ag обозначает сравнение групп по содержанию пропионовой, уксусной, масляной, изовалериановой, валериановой, капроновой и изомасляной кислот соответственно. Были обнаружены значительные различия в уровнях фекальной пропионовой, уксусной, масляной, изовалериановой и изомасляной кислот между тремя группами. ET — эссенциальный тремор, болезнь Паркинсона, здоровые контрольные лица, SCFA. Значимые различия обозначены *P < 0,05 и **P < 0,01.
Учитывая различия в течении заболевания между группой ЭТ и группой ПД, мы изучили 33 пациента с ранней стадией ПД и 16 пациентов с ЭТ (продолжительность заболевания <3 лет) для дальнейшего сравнения (дополнительная таблица 2). Результаты показали, что содержание пропионовой кислоты в кале у пациентов с ЭТ было значительно ниже, чем у пациентов с ГК (P=0,015). Разница между ЭТ и ГК по содержанию масляной и изомасляной кислот не была значительной, но наблюдалась тенденция (P = 0,082). Уровни изомасляной кислоты в кале были значительно ниже у пациентов с ЭТ по сравнению с пациентами с ПД (P = 0,030). Разница между ЭТ и ПД по содержанию изовалериановой кислоты не была значительной, но наблюдалась тенденция (P = 0,084). У пациентов с болезнью Паркинсона уровни пропионовой кислоты (P = 0,023), уксусной кислоты (P = 0,020) и масляной кислоты (P = 0,044) были значительно ниже, чем у здоровых людей. Эти результаты (дополнительный рисунок 1) в целом согласуются с основными результатами. Разница в результатах между общей выборкой и подгруппой пациентов на ранней стадии может быть обусловлена ​​меньшим размером выборки в подгруппе, что приводит к меньшей статистической мощности данных.
Далее мы исследовали, могут ли уровни короткоцепочечных жирных кислот в кале различать пациентов с эссенциальной тромбоцитемией (ЭТ) от пациентов с хронической крапивницей (ХК) или панкреатитом (ХК). Согласно ROC-анализу, разница в AUC уровней пропионата составила 0,668 (95% ДИ: 0,538–0,797), что позволило отличить пациентов с ЭТ от здоровых контрольных лиц (ЗК). Пациентов с ЭТ и ХК можно было различить по уровням бутирата с AUC 0,685 (95% ДИ: 0,556–0,814). Различия в уровнях изомасляной кислоты могут отличать пациентов с ЭТ от ЗК с AUC 0,655 (95% ДИ: 0,525–0,786). При комбинировании уровней пропионата, бутирата и изобутирата была получена более высокая AUC 0,751 (95% ДИ: 0,634–0,867) с чувствительностью 74,3% и специфичностью 72,9% (рис. 2a). Для дифференциации пациентов с ЭТ и ПД AUC для уровней изовалериановой кислоты составила 0,700 (95% ДИ: 0,579–0,822), а для уровней изобутировой кислоты — 0,718 (95% ДИ: 0,599–0,836). Комбинация уровней изовалериановой и изобутировой кислот имела более высокую AUC 0,743 (95% ДИ: 0,629–0,857), чувствительность 74,3% и специфичность 62,9% (рис. 2b). Кроме того, мы исследовали, отличаются ли уровни короткоцепочечных жирных кислот (КЖК) в фекалиях пациентов с болезнью Паркинсона от контрольной группы. Согласно ROC-анализу, AUC для идентификации пациентов с болезнью Паркинсона на основе различий в уровнях пропионовой кислоты составила 0,687 (95% ДИ: 0,559–0,814), при чувствительности 68,6% и специфичности 68,7%. Различия в уровнях ацетата могут отличать пациентов с болезнью Паркинсона от здоровых людей с AUC 0,674 (95% ДИ: 0,542–0,805). Пациентов с болезнью Паркинсона можно отличить от хронической крапивницы только по уровням бутирата с AUC 0,651 (95% ДИ: 0,515–0,787). При объединении уровней пропионата, ацетата и бутирата была получена AUC 0,682 (95% ДИ: 0,553–0,811) (рис. 2c).
а) дискриминация со стороны Русской православной церкви в отношении эссенциального тремора и здоровых контрольных лиц; б) дискриминация по признаку ROC в отношении эссенциального тремора и болезни Паркинсона; в) дискриминация по признаку ROC в отношении болезни Паркинсона и здоровых контрольных лиц; эссенциальный тремор, болезнь Паркинсона, здоровые контрольные лица, SCFA.
У пациентов с ЭТ уровень изомасляной кислоты в кале отрицательно коррелировал с показателем FTM (r = -0,349, P = 0,034), а уровень изовалериановой кислоты в кале отрицательно коррелировал с показателем FTM (r = -0,421, P = 0,001) и показателем TETRAS (r = -0,382, P = 0,020). У пациентов с ЭТ и ПД уровень пропионата в кале отрицательно коррелировал с показателями SCOPA-AUT (r = −0,236, P = 0,043) (рис. 3 и дополнительная таблица 3). Значимой корреляции между течением заболевания и КЖК не было ни в группе ЭТ (P ≥ 0,161), ни в группе ПД (P ≥ 0,246) (дополнительная таблица 4). У пациентов с болезнью Паркинсона уровни капроновой кислоты в кале положительно коррелировали с показателями MDS-UPDRS (r = 0,335, P = 0,042). У всех участников исследования уровни пропионата (r = −0,230, P = 0,016) и ацетата (r = −0,210, P = 0,029) в кале отрицательно коррелировали с показателями по шкале Векснера (рис. 3 и дополнительная таблица 3).
Уровни изомасляной кислоты в кале отрицательно коррелировали с показателями FTM, изовалериановая кислота отрицательно коррелировала с показателями FTM и TETRAS, пропионовая кислота отрицательно коррелировала с показателями SCOPA-AUT, капроновая кислота положительно коррелировала с показателями MDS-UPDRS, а пропионовая кислота отрицательно коррелировала с показателями FTM и TETRAS. Показатели TETRAS и уксусной кислоты отрицательно коррелировали с оценкой по шкале Векснера. MDS-UPDRS — версия Единой шкалы оценки болезни Паркинсона, спонсируемая Ассоциацией, краткая шкала оценки психического состояния (MMSE), шкала оценки депрессии Гамильтона (HAMD-17), 17 пунктов, шкала оценки тревожности Гамильтона (HAMA), стадии Хоэна и Яра (HY), SCFA, шкала оценки вегетативных симптомов болезни Паркинсона SCOPA – AUT, клиническая шкала оценки тремора Фана-Толоса-Марин (FTM), шкала оценки эссенциального тремора исследовательской группы TETRAS (TRG). Значимые различия обозначены *P < 0,05 и **P < 0,01.
Мы дополнительно изучили дискриминационный характер кишечной микробиоты с помощью анализа LEfSE и выбрали уровень данных об относительной численности родов для дальнейшего анализа. Были проведены сравнения между группами ET и HC, а также между группами ET и PD. Затем был выполнен корреляционный анализ Спирмена относительной численности кишечной микробиоты и уровней короткоцепочечных жирных кислот в фекалиях в двух сравниваемых группах.
При анализе ET и CA присутствовали Faecalibacterium (корреляция с масляной кислотой, r = 0,408, P < 0,001), Lactobacillus (корреляция с масляной кислотой, r = 0,283, P = 0,016) и Streptobacterium (корреляция с пропионовой кислотой, r = 0,327). P = 0,005; коррелировали с масляной кислотой, r = 0,374, P = 0,001; Коррелирует с изомасляной кислотой (r = 0,329, P = 0,005), Howardella (коррелирует с пропионовой кислотой, r = 0,242, P = 0,041), Raoultella (коррелирует с пропионатом, r = 0,249, P = 0,035) и Candidatus Arthromitus (коррелирует с изомасляной кислотой, r = 0,302, P = 0,010) снижается в ЭТ и положительно коррелирует с уровнями короткоцепочечных жирных кислот в фекалиях. Однако численность Stenotropomonas увеличилась в ЭТ и отрицательно коррелировала с уровнями изомасляной кислоты в фекалиях (r = -0,250, P = 0,034). После корректировки по методу FDR значимой осталась только корреляция между Faecalibacterium, Catenibacter и SCFA (P ≤ 0,045) (рис. 4 и дополнительная таблица 5).
Корреляционный анализ ЭТ и ГК. После корректировки по FDR было обнаружено, что численность Faecalibacterium (положительно связанная с бутиратом) и Streptobacterium (положительно связанная с пропионатом, бутиратом и изобутиратом) снижена при ЭТ и положительно связана с уровнями короткоцепочечных жирных кислот (КЖК) в кале. b Корреляционный анализ ЭТ и БП. После корректировки по FDR значимых ассоциаций обнаружено не было. ЭТ — эссенциальный тремор, болезнь Паркинсона, здоровые ГК, КЖК. Значимые различия обозначены *P < 0,05 и **P < 0,01.
При сравнении ЭТ и ПД было обнаружено увеличение количества Clostridium trichophyton в ЭТ, коррелирующее с изовалериановой кислотой в фекалиях (r = -0,238, P = 0,041) и изомасляной кислотой (r = -0,257, P = 0,027). После корректировки FDR оба показателя оставались значимыми (P≥0,295) (Рисунок 4 и Дополнительная таблица 5).
Данное исследование представляет собой всестороннее изучение уровней короткоцепочечных жирных кислот (КЖК) в кале и их корреляцию с изменениями кишечной микробиоты и тяжестью симптомов у пациентов с эссенциальной тромбоцитемией (ЭТ) по сравнению с пациентами с хронической крапивницей (ХК) и болезнью Паркинсона (БП). Мы обнаружили, что уровни КЖК в кале были снижены у пациентов с ЭТ и были связаны с клинической тяжестью и специфическими изменениями кишечной микробиоты. Кумулятивные уровни короткоцепочечных жирных кислот (КЖК) в кале позволяют дифференцировать ЭТ от хронической крапивницы (ХК) и БП.
По сравнению с пациентами с раком желудка, у пациентов с эссенциальной тромбоцитемией (ЭТ) наблюдается более низкий уровень пропионовой, масляной и изомасляной кислот в кале. Комбинация пропионовой, масляной и изомасляной кислот позволила дифференцировать ЭТ и здоровых контрольных лиц (ГК) с AUC 0,751 (95% ДИ: 0,634–0,867), чувствительностью 74,3% и специфичностью 72,9%, что указывает на возможность их использования в качестве диагностических биомаркеров для потенциальной роли ЭТ. Дальнейший анализ показал, что уровень пропионовой кислоты в кале отрицательно коррелировал с оценкой по шкале Векснера и оценкой по шкале SCOPA-AUT. Уровень изомасляной кислоты в кале обратно коррелировал с показателями FTM. С другой стороны, снижение уровня бутирата у пациентов с ЭТ было связано со снижением численности микробиоты, продуцирующей короткоцепочечные жирные кислоты (КЖК), Faecalibacterium и Categorybacter. Кроме того, снижение численности бактерий рода Catenibacter в ET также было связано со снижением уровня пропионовой и изомасляной кислот в фекалиях.
Большинство короткоцепочечных жирных кислот (КЖК), образующихся в толстой кишке, поглощаются колоноцитами преимущественно через H+-зависимые или натрий-зависимые монокарбоксилатные транспортеры. Абсорбированные короткоцепочечные жирные кислоты используются колоноцитами в качестве источника энергии, тогда как те, которые не метаболизируются в колоноцитах, транспортируются в портальное кровообращение 18. КЖК могут влиять на моторику кишечника, улучшать функцию кишечного барьера и влиять на метаболизм и иммунитет хозяина19. Ранее было установлено, что фекальные концентрации бутирата, ацетата и пропионата были снижены у пациентов с болезнью Паркинсона по сравнению со здоровыми контрольными группами17, что согласуется с нашими результатами. В нашем исследовании было обнаружено снижение уровня КЖК у пациентов с эссенциальной тромбоцитемией (ЭТ), но о роли КЖК в патологии ЭТ известно немного. Бутират и пропионат могут связываться с GPCR и влиять на GPCR-зависимую передачу сигналов, таких как MAPK и NF-κB20. Основная концепция оси «кишечник-мозг» заключается в том, что короткоцепочечные жирные кислоты (КЖК), секретируемые кишечными микробами, могут влиять на сигнальные пути хозяина, тем самым воздействуя на функции кишечника и мозга. Поскольку бутират и пропионат обладают мощным ингибирующим действием на активность гистондеацетилазы (ГДАК)21, а бутират также может выступать в качестве лиганда для факторов транскрипции, они оказывают широкое влияние на метаболизм, дифференцировку и пролиферацию хозяина, главным образом, благодаря своему влиянию на регуляцию генов22. На основании данных о КЖК и нейродегенеративных заболеваниях бутират рассматривается как терапевтический кандидат благодаря своей способности корректировать нарушенную активность ГДАК, которая может опосредовать гибель дофаминергических нейронов при болезни Паркинсона23,24,25. Исследования на животных также продемонстрировали способность масляной кислоты предотвращать дегенерацию дофаминергических нейронов и улучшать двигательные расстройства в моделях болезни Паркинсона26,27. Было обнаружено, что пропионовая кислота ограничивает воспалительные реакции и защищает целостность гематоэнцефалического барьера28,29. Исследования показали, что пропионовая кислота способствует выживанию дофаминергических нейронов в ответ на токсичность ротенона в моделях болезни Паркинсона 30, и что пероральное введение пропионовой кислоты предотвращает потерю дофаминергических нейронов и двигательные нарушения у мышей с болезнью Паркинсона 31. О функции изомасляной кислоты известно немного. Однако недавнее исследование показало, что колонизация мышей B. ovale увеличивает содержание короткоцепочечных жирных кислот (КЖК) в кишечнике (включая ацетат, пропионат, изомасляную кислоту и изовалерат) и концентрацию ГАМК в кишечнике, подчеркивая установленную связь между кишечной микробиотой и концентрацией нейротрансмиттеров в кишечнике 32. При эссенциальном треморе (ЭТ) аномальные патологические изменения в мозжечке включают изменения аксонов и дендритов клеток Пуркинье, смещение и потерю клеток Пуркинье, изменения аксонов корзинчатых клеток, аномалии восходящих волоконных соединений с распределением клеток Пуркинье и изменения рецепторов ГАМК в зубчатой ​​кости. ядра, что приводит к снижению ГАМК-эргической активности мозжечка3,4,33. Остается неясным, связаны ли короткоцепочечные жирные кислоты (КЦЖК) с нейродегенерацией клеток Пуркинье и снижением выработки ГАМК в мозжечке. Наши результаты указывают на сильную связь между КЦЖК и эссенциальным тремором (ЭТ), но поперечное исследование не позволяет сделать какие-либо выводы о причинно-следственной связи между КЦЖК и патологическим процессом ЭТ; необходимы дальнейшие продольные исследования, включая серийные измерения КЦЖК в кале, а также исследования на животных для изучения механизмов.
Считается, что короткоцепочечные жирные кислоты (КЦЖК) стимулируют сократительную способность гладких мышц толстой кишки34. Недостаток КЦЖК усугубит симптомы запора, а добавление КЦЖК может улучшить симптомы запора35. Наши результаты также указывают на значительную связь между снижением содержания КЦЖК в кале и усилением запора и вегетативной дисфункции у пациентов с эссенциальным тремором (ЭТ). В одном клиническом случае было обнаружено, что трансплантация микробиоты улучшила как эссенциальный тремор, так и синдром раздраженного кишечника у пациента 7, что еще раз подтверждает тесную связь между кишечной микробиотой и ЭТ. Поэтому мы считаем, что КЦЖК/микробиота в кале могут влиять на моторику кишечника хозяина и функцию вегетативной нервной системы.
Исследование показало, что снижение уровня фекальных короткоцепочечных жирных кислот (КЦЖК) у пациентов с ЭТ было связано со снижением численности Faecalibacterium (связанной с бутиратом) и Streptobacterium (связанной с пропионатом, бутиратом и изобутиратом). После коррекции FDR эта взаимосвязь остается значимой. Faecalibacterium и Streptobacterium являются микроорганизмами, продуцирующими КЦЖК. Известно, что Faecalibacterium является микроорганизмом, продуцирующим бутират36, в то время как основными продуктами ферментации Catenibacter являются ацетат, бутират и молочная кислота37. Faecalibacterium был обнаружен у 100% пациентов как в группе ЭТ, так и в группе HC; медианная относительная численность в группе ЭТ составила 2,06%, а в группе HC — 3,28% (LDA 3,870). Бактерии этой категории были обнаружены у 21,6% (8/37) пациентов в группе HC и только в 1 образце в группе ЭТ (1/35). Снижение и необнаружимость стрептобактерий при ЭТ также могут указывать на корреляцию с патогенностью заболевания. Медианная относительная численность видов Catenibacter в группе HC составила 0,07% (LDA 2,129). Кроме того, молочнокислые бактерии были связаны с изменениями содержания бутирата в фекалиях (P=0,016, P=0,096 после корректировки FDR), а кандидат на артрит был связан с изменениями содержания изобутирата (P=0,016, P=0,072 после корректировки FDR). После коррекции FDR осталась только тенденция корреляции, которая статистически незначима. Известно также, что лактобациллы являются продуцентами короткоцепочечных жирных кислот (уксусной кислоты, пропионовой кислоты, изомасляной кислоты, масляной кислоты) 38, а Candidatus Arthromitus является специфическим индуктором дифференцировки Т-хелперных клеток 17 (Th17), при этом Th1/2 и Treg связаны с иммунным балансом /Th1739. Недавнее исследование предполагает, что повышенный уровень фекального псевдоартрита может способствовать воспалению толстой кишки, дисфункции кишечного барьера и системному воспалению 40. Уровни Clostridium trichoides были повышены при ЭТ по сравнению с БП. Было обнаружено, что количество Clostridium trichoides отрицательно коррелирует с изовалериановой кислотой и изомасляной кислотой. После корректировки FDR оба показателя оставались значимыми (P≥0,295). Clostridium pilosum — это бактерия, известная своей связью с воспалением и способная способствовать дисфункции кишечного барьера41. В нашем предыдущем исследовании сообщалось об изменениях в кишечной микробиоте пациентов с ЭТ8. Здесь мы также сообщаем об изменениях в короткоцепочечных жирных кислотах (КЖК) при ЭТ и выявляем связь между кишечным дисбиозом и изменениями в КЖК. Снижение уровней КЖК тесно связано с кишечным дисбиозом и тяжестью тремора при ЭТ. Наши результаты предполагают, что ось «кишечник-мозг» может играть важную роль в патогенезе ЭТ, но необходимы дальнейшие исследования на животных моделях.
По сравнению с пациентами с болезнью Паркинсона, у пациентов с эссенциальной тромбоцитемией (ЭТ) в кале наблюдается более низкий уровень изовалериановой и изомасляной кислот. Комбинация изовалериановой и изомасляной кислот позволила идентифицировать ЭТ у пациентов с болезнью Паркинсона с AUC 0,743 (95% ДИ: 0,629–0,857), чувствительностью 74,3% и специфичностью 62,9%, что указывает на их потенциальную роль в качестве биомаркеров в дифференциальной диагностике ЭТ. Уровни изовалериановой кислоты в кале обратно коррелировали с показателями FTM и TETRAS. Уровни изомасляной кислоты в кале также обратно коррелировали с показателями FTM. Снижение уровня изомасляной кислоты было связано со снижением численности катобактерий. Функции изовалериановой и изомасляной кислот изучены недостаточно. Предыдущее исследование показало, что колонизация мышей B. ovale увеличила количество кишечных короткоцепочечных жирных кислот (включая ацетат, пропионат, изомасляную кислоту и изовалерат) и концентрацию ГАМК в кишечнике, что подчеркивает связь между микробиотой и концентрацией кишечных короткоцепочечных жирных кислот/нейромедиаторов32. Интересно, что наблюдаемые уровни изомасляной кислоты были схожими между группами пациентов с болезнью Паркинсона (БП) и здоровых контрольных лиц (ЗК), но различались между группами пациентов с эссенциальным тремором (ЭТ) и БП (или ЗК). Изомасляная кислота могла различать ЭТ и БП с AUC 0,718 (95% ДИ: 0,599–0,836) и идентифицировать ЭТ и здоровых контрольных лиц (ЗК) с AUC 0,655 (95% ДИ: 0,525–0,786). Кроме того, уровни изомасляной кислоты коррелируют с тяжестью тремора, что еще больше усиливает ее связь с ЭТ. Вопрос о том, может ли пероральный прием изомасляной кислоты снизить выраженность тремора у пациентов с эссенциальным тремором, заслуживает дальнейшего изучения.
Таким образом, содержание короткоцепочечных жирных кислот (КЦЖК) в кале снижено у пациентов с эссенциальной тромбоцитемией (ЭТ) и связано с клинической тяжестью ЭТ и специфическими изменениями кишечной микробиоты. Фекальные пропионат, бутират и изобутират могут быть диагностическими биомаркерами ЭТ, тогда как изобутират и изовалерат могут быть дифференциально-диагностическими биомаркерами ЭТ. Изменения содержания изобутирата в кале могут быть более специфичными для ЭТ, чем изменения содержания других КЦЖК.
Наше исследование имеет несколько ограничений. Во-первых, особенности питания и пищевые предпочтения могут влиять на экспрессию микробиоты, необходимы более крупные выборки в различных популяциях, а в будущих исследованиях следует использовать комплексные и систематические диетические обследования, такие как анкеты частоты потребления продуктов. Во-вторых, поперечное исследование не позволяет сделать какие-либо выводы о причинно-следственной связи между короткоцепочечными жирными кислотами (КЖК) и патологическим процессом эссенциального тремора (ЭТ). Необходимы дальнейшие долгосрочные исследования с серийными измерениями КЖК в кале. В-третьих, диагностические и дифференциально-диагностические возможности уровней КЖК в кале следует подтвердить с использованием независимых образцов от пациентов с ЭТ, здоровых контрольных лиц (ЗК) и пациентов с болезнью Паркинсона (БП). В будущем следует протестировать больше независимых образцов стула. Наконец, у пациентов с БП в нашей когорте продолжительность заболевания была значительно короче, чем у пациентов с ЭТ. Мы в основном подбирали пациентов с ЭТ, БП и ЗК по возрасту, полу и ИМТ. Учитывая разницу в течении заболевания между группой ЭТ и группой БП, мы также изучили 33 пациента с ранней стадией БП и 16 пациентов с ЭТ (продолжительность заболевания ≤3 лет) для дальнейшего сравнения. Различия между группами по содержанию короткоцепочечных жирных кислот (КЖК) в целом соответствовали нашим основным данным. Кроме того, мы не обнаружили корреляции между длительностью заболевания и изменениями содержания КЖК. Однако в будущем было бы целесообразно набрать пациентов с болезнью Паркинсона и эссенциальным тремором на ранней стадии заболевания с меньшей длительностью, чтобы завершить валидацию на большей выборке.
Протокол исследования был одобрен Комитетом по этике больницы Руйцзинь, входящей в состав Медицинской школы Шанхайского университета Цзяотун (RHEC2018-243). От всех участников было получено письменное информированное согласие.
В период с января 2019 по декабрь 2022 года в исследование были включены 109 пациентов (37 с эссенциальным тремором, 37 с болезнью Паркинсона и 35 здоровых контрольных лиц) из клиники Центра двигательных расстройств больницы Руйцзинь, входящей в состав Медицинской школы Шанхайского университета Цзяотун. Критерии отбора: (1) возраст 25–85 лет, (2) диагноз эссенциального тремора был поставлен в соответствии с критериями Рабочей группы по двигательным расстройствам (MDS) 42, а диагноз болезни Паркинсона — в соответствии с критериями MDS 43, (3) все пациенты не принимали противопаркинсонические препараты до сбора образцов, (4) группа пациентов с эссенциальным тремором принимала только бета-блокаторы или не принимала никаких аналогичных препаратов до сбора образцов кала. Также были отобраны здоровые контрольные лица, соответствующие по возрасту, полу и индексу массы тела (ИМТ). Критерии исключения: (1) вегетарианство, (2) плохое питание, (3) хронические заболевания желудочно-кишечного тракта (включая воспалительные заболевания кишечника, язвы желудка или двенадцатиперстной кишки), (4) тяжелые хронические заболевания (включая злокачественные новообразования), сердечная недостаточность, почечная недостаточность, гематологические заболевания, (5) наличие в анамнезе серьезных операций на желудочно-кишечном тракте, (6) хроническое или регулярное употребление йогурта, (7) использование любых пробиотиков или антибиотиков в течение 1 месяца, (8) хроническое применение кортикостероидов, ингибиторов протонной помпы, статинов, метформина, иммуносупрессантов или противоопухолевых препаратов и (9) тяжелые когнитивные нарушения, препятствующие проведению клинических исследований.
Все участники исследования предоставили медицинскую историю, информацию о весе и росте для расчета ИМТ, а также прошли неврологическое обследование и клиническую оценку, включающую оценку тревожности по шкале Гамильтона (HAMA) 44, оценку депрессии по шкале Гамильтона-17 (HAMD-17) 45, оценку тяжести запора по шкале Векснера 46 и Бристольской шкале стула 47, а также оценку когнитивных функций с помощью краткой шкалы оценки психического состояния (MMSE) 48. Шкала оценки вегетативных симптомов болезни Паркинсона (SCOPA-AUT) 49 использовалась для оценки вегетативной дисфункции у пациентов с эссенциальным тремором (ЭТ) и болезнью Паркинсона (БП). Клиническая шкала оценки тремора Фана-Толоса-Марина (FTM) и шкала оценки эссенциального тремора (TETRAS) 50 были обследованы группой исследования тремора (TRG) 50 у пациентов с ЭТ; Были изучены шкала оценки болезни Кинсона (MDS-), разработанная Объединенной ассоциацией по борьбе с болезнью Паркинсона; версия 51 шкалы UPDRS и версия 52 шкалы Хоэна и Яра (HY).
Каждому участнику было предложено собрать образец кала утром с помощью специального контейнера для сбора кала. Контейнеры помещали на лед и хранили при температуре -80°C до обработки. Анализ короткоцепочечных жирных кислот (КЖК) проводился в соответствии со стандартными процедурами компании Tiangene Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. У каждого участника было собрано 400 мг свежих образцов кала, которые анализировались с использованием КЖК после измельчения и ультразвуковой обработки. Выбранные КЖК в кале анализировались с помощью газовой хроматографии-масс-спектрометрии (ГХ-МС) и жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии (ЖХ-МС/МС).
ДНК была выделена из образцов массой 200 мг с использованием набора QIAamp® Fast DNA Stool Mini Kit (QIAGEN, Хильден, Германия) в соответствии с инструкциями производителя. Микробный состав определяли путем секвенирования гена 16S рРНК на ДНК, выделенной из фекалий, с амплификацией области V3-V4. ДНК анализировали, проводя электрофорез образца на 1,2% агарозном геле. Амплификация гена 16S рРНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) проводилась с использованием универсальных бактериальных праймеров (357 F и 806 R) и двухэтапной библиотеки ампликонов, созданной на платформе Novaseq.
Непрерывные переменные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение, а категориальные переменные — как числа и проценты. Для проверки однородности дисперсий использовался тест Левена. Сравнения проводились с использованием двухсторонних t-критериев или дисперсионного анализа (ANOVA), если переменные имели нормальное распределение, и непараметрических критериев Манна-Уитни, если нарушались предположения о нормальности или гомоскедастичности. Площадь под кривой рабочей характеристики приемника (ROC) (AUC) использовалась для количественной оценки диагностической эффективности модели и изучения способности SCFA различать пациентов с ET от пациентов с HC или PD. Для изучения взаимосвязи между SCFA и клинической тяжестью использовался корреляционный анализ Спирмена. Статистический анализ проводился с использованием программного обеспечения SPSS (версия 22.0; SPSS Inc., Чикаго, Иллинойс) с уровнем значимости (включая значение P и FDR-P) 0,05 (двусторонний).
Анализ последовательностей 16S рРНК проводился с использованием комбинации программного обеспечения Trimmomatic (версия 0.35), Flash (версия 1.2.11), UPARSE (версия v8.1.1756), mothur (версия 1.33.3) и R (версия 3.6.3). Исходные данные гена 16S рРНК обрабатывались с помощью UPARSE для генерации операционных таксономических единиц (ОТУ) с 97% идентичностью. Таксономии определялись с использованием базы данных Silva 128 в качестве эталонной. Для дальнейшего анализа был выбран родовой уровень данных об относительной численности. Для сравнения между группами (ET против HC, ET против PD) использовался анализ размера эффекта линейного дискриминантного анализа (LDA) (LEfSE) с порогом α = 0,05 и порогом размера эффекта = 2,0. Дискриминантные роды, идентифицированные с помощью анализа LEfSE, далее использовались для корреляционного анализа Спирмена для короткоцепочечных жирных кислот (КЖК).
Более подробную информацию о методологии исследования см. в аннотации к отчету о естественно-научном исследовании, прилагаемой к данной статье.
Исходные данные секвенирования 16S хранятся в базе данных BioProject Национального центра биотехнологической информации (NCBI) (SRP438900: PRJNA974928), URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/study/?acc= SRP438900&o. =acc_s% 3Aa. Другие соответствующие данные могут быть предоставлены соответствующему автору по обоснованному запросу, например, в рамках научного сотрудничества и академического обмена в рамках полномасштабных исследовательских проектов. Передача данных третьим лицам без нашего согласия запрещена.
Открытый исходный код допускается только при использовании комбинации Trimmomatic (версия 0.35), Flash (версия 1.2.11), UPARSE (версия v8.1.1756), mothur (версия 1.33.3) и R (версия 3.6.3) с настройками по умолчанию или разделом «Метод». Дополнительная уточняющая информация может быть предоставлена ​​соответствующему автору по обоснованному запросу.
Прадип С. и Механна Р. Желудочно-кишечные расстройства при гиперкинетических двигательных расстройствах и атаксии, ассоциированные с болезнью Паркинсона. Спутанность сознания. 90, 125–133 (2021).
Луис, Э. Д. и Фауст, П. Л. Патология эссенциального тремора: нейродегенерация и реорганизация нейронных связей. Nat. Pastor Nirol. 16, 69–83 (2020).
Жиронелл, А. Является ли эссенциальный тремор первичным расстройством дисфункции ГАБА? Да. Internationality. Rev. Neuroscience. 163, 259–284 (2022).
Догра Н., Мани Р.Дж. и Катара Д.П. Ось кишечник-мозг: два режима передачи сигналов при болезни Паркинсона. Клеточные молекулы. Нейробиология. 42, 315–332 (2022).
Куигли, Э.М.М. Ось микробиота-мозг-кишечник и нейродегенеративные заболевания. Текущие. Неллоре. Нейробиология. Отчеты 17, 94 (2017).
Лю, С.Дж., У, Л.Х., Се, В.Р. и Хэ, С.Х. Трансплантация фекальной микробиоты одновременно улучшает эссенциальный тремор и синдром раздраженного кишечника у пациентов. Гериатрическая психология 20, 796–798 (2020).
Чжан П. и др. Специфические изменения кишечной микробиоты при эссенциальном треморе и их дифференциация от болезни Паркинсона. NPJ Болезнь Паркинсона. 8, 98 (2022).
Ло С., Чжу Х., Чжан Ц. и Ван Д. Критическая роль микробиоты в регуляции нейронно-глиально-эпителиальных единиц. Устойчивость к инфекциям. 14, 5613–5628 (2021).
Эмин А. и др. Патология альфа-синуклеина двенадцатиперстной кишки и кишечного глиоза при прогрессирующей болезни Паркинсона. move. confusion. https://doi.org/10.1002/mds.29358 (2023).
Скорванек М. и др. Антитела к альфа-синуклеину 5G4 распознают явную болезнь Паркинсона и продромальную болезнь Паркинсона в слизистой оболочке толстой кишки. move. confusion. 33, 1366–1368 (2018).
Алгарни М. и Фазано А. Совпадение эссенциального тремора и болезни Паркинсона. Спутанность сознания, связанная с болезнью Паркинсона. 46, С101–С104 (2018).
Сэмпсон, Т.Р. и др. Микробиота кишечника модулирует двигательные нарушения и нейровоспаление в моделях болезни Паркинсона. Cell 167, 1469–1480.e1412 (2016).
Унгер, М.М. и др. Короткоцепочечные жирные кислоты и микробиота кишечника различаются у пациентов с болезнью Паркинсона и контрольной группы соответствующего возраста. Связано с болезнью Паркинсона. спутанность сознания. 32, 66–72 (2016).
Бличер Э., Леви М., Татировский Э. и Элинав Э. Метаболиты, регулируемые микробиомом на границе взаимодействия хозяина и иммунной системы. Журнал иммунологии. 198, 572–580 (2017).