Спасибо за посещение сайта Nature.com. Версия используемого вами браузера имеет ограниченную поддержку CSS. Для достижения наилучших результатов мы рекомендуем использовать более новую версию вашего браузера (или отключить режим совместимости в Internet Explorer). В настоящее время, для обеспечения дальнейшей поддержки, мы отображаем сайт без стилей и JavaScript.
Пропионовая кислота (PPA) используется для изучения роли митохондриальной дисфункции в нейроразвивающих расстройствах, таких как расстройства аутистического спектра. Известно, что PPA нарушает митохондриальный биогенез, метаболизм и обновление. Однако влияние PPA на динамику митохондрий, деление и слияние остается проблематичным из-за сложной временной природы этих механизмов. В данном исследовании мы используем дополнительные количественные методы визуализации для изучения того, как PPA влияет на ультраструктуру, морфологию и динамику митохондрий в нейроноподобных клетках SH-SY5Y. PPA (5 мМ) вызывала значительное уменьшение площади митохондрий (p < 0,01), диаметра Феррета и окружности (p < 0,05), а также площади 2 (p < 0,01). Анализ локаторов митохондриальных событий показал значительное увеличение (p < 0,05) числа событий деления и слияния, тем самым поддерживая целостность митохондриальной сети в условиях стресса. Кроме того, экспрессия мРНК cMYC (p < 0,0001), NRF1 (p < 0,01), TFAM (p < 0,05), STOML2 (p < 0,0001) и OPA1 (p < 0,05) была значительно снижена. 01). Это иллюстрирует ремоделирование морфологии, биогенеза и динамики митохондрий для поддержания их функции в условиях стресса. Наши данные дают новое представление о влиянии PPA на динамику митохондрий и подчеркивают полезность методов визуализации для изучения сложных регуляторных механизмов, участвующих в стрессовых реакциях митохондрий.
Митохондрии играют важную роль в различных клеточных процессах, выходящих за рамки их типичных функций в производстве и биосинтезе энергии. Митохондриальный метаболизм является ключевым регулятором кальциевой сигнализации, метаболического и окислительно-восстановительного гомеостаза, воспалительной сигнализации, эпигенетических модификаций, пролиферации клеток, дифференцировки и запрограммированной клеточной смерти1. В частности, митохондриальный метаболизм имеет решающее значение для развития, выживания и функционирования нейронов и широко вовлечен в различные проявления нейропатологии2,3,4.
За последнее десятилетие метаболический статус стал рассматриваться как центральный регулятор нейрогенеза, дифференцировки, созревания и пластичности5,6. В последнее время морфология и динамика митохондрий стали особенно важными компонентами митоза — динамического процесса, поддерживающего пул здоровых митохондрий внутри клеток. Динамика митохондрий регулируется сложными взаимозависимыми путями, начиная от митохондриального биогенеза и биоэнергетики и заканчивая митохондриальным делением, слиянием, транспортом и очисткой7,8. Нарушение любого из этих интегративных механизмов ухудшает поддержание здоровых митохондриальных сетей и имеет серьезные функциональные последствия для нейроразвития9,10. Действительно, нарушение регуляции динамики митохондрий наблюдается при многих психических, нейродегенеративных и нейроразвивающих расстройствах, включая расстройства аутистического спектра (РАС)11,12.
Расстройства аутистического спектра (РАС) — это гетерогенное нейроразвивающее расстройство со сложной генетической и эпигенетической архитектурой. Наследственность РАС не вызывает сомнений, но лежащая в основе молекулярная этиология остается недостаточно изученной. Накопленные данные доклинических моделей, клинических исследований и мультиомиксных молекулярных наборов данных предоставляют все больше доказательств митохондриальной дисфункции при РАС13,14. Ранее мы провели полногеномный скрининг метилирования ДНК в когорте пациентов с РАС и выявили дифференциально метилированные гены, сгруппированные вдоль митохондриальных метаболических путей15. Впоследствии мы сообщили о дифференциальном метилировании центральных регуляторов митохондриального биогенеза и динамики, которое было связано с увеличением числа копий мтДНК и изменением метаболического профиля мочи при РАС16. Наши данные предоставляют все больше доказательств того, что митохондриальная динамика и гомеостаз играют центральную роль в патофизиологии РАС. Таким образом, улучшение механистического понимания взаимосвязи между динамикой, морфологией и функцией митохондрий является ключевой целью текущих исследований неврологических заболеваний, характеризующихся вторичной митохондриальной дисфункцией.
Молекулярные методы часто используются для изучения роли конкретных генов в митохондриальных стрессовых реакциях. Однако этот подход может быть ограничен многогранным и временным характером механизмов контроля митоза. Более того, дифференциальная экспрессия митохондриальных генов является косвенным индикатором функциональных изменений, особенно учитывая, что обычно анализируется лишь ограниченное количество генов. Поэтому были предложены более прямые методы изучения митохондриальной функции и биоэнергетики17. Морфология митохондрий тесно связана с динамикой митохондрий. Форма, связность и структура митохондрий имеют решающее значение для производства энергии, а также для выживания митохондрий и клеток5,18. Кроме того, различные компоненты митоза фокусируются на изменениях морфологии митохондрий, которые могут служить полезными конечными точками митохондриальной дисфункции и обеспечивать основу для последующих механистических исследований.
Морфологию митохондрий можно непосредственно наблюдать с помощью трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ), что позволяет детально изучать клеточную ультраструктуру. ТЭМ позволяет непосредственно визуализировать морфологию, форму и структуру митохондриальных крист с разрешением отдельных митохондрий, вместо того чтобы полагаться исключительно на транскрипцию генов, экспрессию белков или функциональные параметры митохондрий в клеточных популяциях17,19,20. Кроме того, ТЭМ облегчает изучение взаимодействий между митохондриями и другими органеллами, такими как эндоплазматический ретикулум и аутофагосомы, которые играют ключевую роль в функционировании и гомеостазе митохондрий21,22. Таким образом, это делает ТЭМ хорошей отправной точкой для изучения митохондриальной дисфункции, прежде чем фокусироваться на конкретных путях или генах. Поскольку функция митохондрий приобретает все большее значение для нейропатологии, возникает очевидная необходимость в возможности прямого и количественного изучения морфологии и динамики митохондрий в нейрональных моделях in vitro.
В этой статье мы исследуем динамику митохондрий в нейрональной модели митохондриальной дисфункции при расстройствах аутистического спектра. Ранее мы сообщали о дифференциальном метилировании бета-пропионил-КоА-карбоксилазы (PCCB) при РАС15, субъединицы митохондриального фермента пропионил-КоА-карбоксилазы PCC. Известно, что дисрегуляция PCC вызывает токсическое накопление пропионильных производных, включая пропионовую кислоту (PPA)23,24,25. Было показано, что PPA нарушает нейрональный метаболизм и изменяет поведение in vivo и является устоявшейся животной моделью для изучения нейроразвитийных механизмов, участвующих в РАС26,27,28. Кроме того, сообщалось, что PPA нарушает митохондриальный мембранный потенциал, биогенез и дыхание in vitro и широко используется для моделирования митохондриальной дисфункции в нейронах29,30. Однако влияние вызванной PPA митохондриальной дисфункции на морфологию и динамику митохондрий остается недостаточно изученным.
В данном исследовании используются дополнительные методы визуализации для количественной оценки влияния PPA на морфологию, динамику и функцию митохондрий в клетках SH-SY5Y. Во-первых, мы разработали метод трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ) для визуализации изменений морфологии и ультраструктуры митохондрий17,31,32. Учитывая динамический характер митохондрий33, мы также использовали анализ локализатора митохондриальных событий (MEL) для количественной оценки изменений баланса между событиями деления и слияния, количества и объема митохондрий в условиях стресса, вызванного PPA. Наконец, мы изучили, связаны ли морфология и динамика митохондрий с изменениями экспрессии генов, участвующих в биогенезе, делении и слиянии. В совокупности наши данные иллюстрируют сложность выяснения механизмов, регулирующих динамику митохондрий. Мы подчеркиваем полезность ТЭМ в изучении морфологии митохондрий как измеримого конечного показателя митоза в клетках SH-SY5Y. Кроме того, мы подчеркиваем, что данные трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ) предоставляют наиболее полную информацию в сочетании с методами визуализации, которые также позволяют фиксировать динамические события в ответ на метаболический стресс. Дальнейшая характеристика молекулярных регуляторных механизмов, поддерживающих митоз нейронных клеток, может дать важное представление о митохондриальном компоненте нервной системы и нейродегенеративных заболеваний.
Для индукции митохондриального стресса клетки SH-SY5Y обрабатывали PPA с использованием 3 мМ и 5 мМ пропионата натрия (NaP). Перед ТЭМ образцы подвергали криогенной подготовке с использованием высокоскоростного замораживания и замораживания (рис. 1a). Мы разработали автоматизированный конвейер анализа митохондриальных изображений для измерения восьми морфологических параметров митохондриальных популяций в трех биологических повторах. Мы обнаружили, что обработка PPA значительно изменила четыре параметра: площадь 2, площадь, периметр и диаметр Феррета (рис. 1b–e). Площадь 2 значительно уменьшилась как при обработке 3 мМ, так и при обработке 5 мМ PPA (p = 0,0183 и p = 0,002 соответственно) (рис. 1b), в то время как площадь (p = 0,003), периметр (p = 0,0106) и диаметр Феррета значительно уменьшились. В группе, получавшей 5 мМ PPA, наблюдалось значительное уменьшение (p = 0,0172) по сравнению с контрольной группой (рис. 1c–e). Значительное уменьшение площади и окружности показало, что клетки, обработанные 5 мМ PPA, имели меньшие, более округлые митохондрии, и что эти митохондрии были менее вытянутыми, чем в контрольных клетках. Это также согласуется со значительным уменьшением диаметра Феррета, независимого параметра, указывающего на уменьшение наибольшего расстояния между краями частиц. Наблюдались изменения в ультраструктуре крист: кристы стали менее выраженными под воздействием стресса PPA (рис. 1a, панель B). Однако не все изображения четко отражали ультраструктуру крист, поэтому количественный анализ этих изменений не проводился. Эти данные ТЭМ могут отражать три возможных сценария: (1) PPA усиливает деление или ингибирует слияние, вызывая уменьшение размера существующих митохондрий; (2) усиленный биогенез создает новые, меньшие по размеру митохондрии или (3) индуцирует оба механизма одновременно. Хотя эти состояния нельзя различить с помощью ТЭМ, значительные морфологические изменения указывают на изменения митохондриального гомеостаза и динамики в условиях стресса PPA. Впоследствии мы исследовали дополнительные параметры для дальнейшей характеристики этой динамики и потенциальных механизмов, лежащих в ее основе.
Пропионовая кислота (PPA) изменяет морфологию митохондрий. (a) Репрезентативные изображения, полученные с помощью трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ), показывают, что размер митохондрий уменьшается, а сами митохондрии становятся меньше и более округлыми с увеличением концентрации PPA; 0 мМ (необработанные), 3 мМ и 5 мМ соответственно. Красные стрелки указывают на митохондрии. (b–e) Клетки SH-SY5Y, обработанные PPA в течение 24 ч, были подготовлены для ТЭМ, и результаты были проанализированы с помощью Fiji/ImageJ. Четыре из восьми параметров показали значительные различия между контрольными (необработанные, 0 мМ PPA) и обработанными (3 мМ и 5 мМ PPA) клетками. (b) Область 2, (c) Площадь, (d) Периметр, (e) Диаметр Феррета. Для определения значимых различий (p < 0,05) использовались однофакторный дисперсионный анализ (контроль против обработки) и множественный сравнительный тест Даннетта. Точки данных представляют среднее значение митохондрий для каждой отдельной клетки, а полосы погрешностей представляют среднее значение ± стандартная ошибка среднего. Представленные данные соответствуют n = 3, не менее 24 клеток на каждую повторную выборку; всего было проанализировано 266 изображений; * указывает на p < 0,05, ** указывает на p < 0,01.
Для более детального изучения реакции динамики митохондрий на ППА мы окрасили митохондрии этиловым эфиром тетраметилродамина (TMRE) и использовали покадровую микроскопию и анализ MEL для локализации и количественной оценки митохондрий через 24 часа при концентрациях ППА 3 и 5 мМ. Обработка, отражающая события деления и слияния (рис. 2а). После анализа MEL митохондрии были дополнительно проанализированы для количественной оценки количества митохондриальных структур и их среднего объема. Мы наблюдали небольшое, но значительное увеличение числа событий деления, происходящих при 3 мМ [4,9 ± 0,3 (p < 0,05)] по сравнению с делением [5,6 ± 0,3 (p < 0,05) )] и слиянием [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] и слиянием [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] 0,05)] <0,05)]. События деления были значительно увеличены при 5 мМ по сравнению с контролем (рис. 3b). Число митохондрий значительно увеличилось как при 3 [32,6 ± 2,1 (p < 0,05)], так и при 5 мМ [34,1 ± 2,2 (p < 0,05)] (рис. 3c), в то время как средний объем каждой митохондриальной структуры остался неизменным (рис. 3c). 3d). В совокупности это позволяет предположить, что ремоделирование динамики митохондрий служит компенсаторной реакцией, успешно поддерживающей целостность митохондриальной сети. Увеличение числа событий деления при 3 мМ PPA предполагает, что увеличение числа митохондрий частично обусловлено делением митохондрий, но, учитывая, что средний объем митохондрий остается практически неизменным, биогенез нельзя исключить как дополнительную компенсаторную реакцию. Тем не менее, эти данные согласуются с меньшими, круглыми структурами митохондрий, наблюдаемыми с помощью ТЭМ, и также демонстрируют значительные изменения в динамике митохондрий, вызванные PPA.
Пропионовая кислота (PPA) индуцирует динамическое ремоделирование митохондрий для поддержания целостности сети. Клетки SH-SY5Y культивировали, обрабатывали 3 и 5 мМ PPA в течение 24 часов и окрашивали TMRE и Hoechst 33342 с последующим анализом MEL. (a) Репрезентативные изображения, полученные методом покадровой микроскопии, демонстрирующие цветные и бинаризованные проекции максимальной интенсивности в момент времени 2 (t2) для каждого условия. Выбранные области, указанные на каждом бинарном изображении, усилены и отображены в 3D в трех разных временных интервалах (t1-t3) для иллюстрации динамики во времени; события слияния выделены зеленым цветом; события деления выделены зеленым цветом. Отображаются красным цветом. (b) Среднее количество динамических событий для каждого условия. (c) Среднее количество митохондриальных структур на клетку. (d) Средний объем (мкм³) каждой митохондриальной структуры на клетку. Представленные данные являются репрезентативными для n = 15 клеток на каждую группу обработки. Показаны средние значения ± стандартная ошибка среднего, масштабная линейка = 10 мкм, * p < 0,05.
Пропионовая кислота (PPA) вызывает транскрипционное подавление генов, связанных с динамикой митохондрий. Клетки SH-SY5Y обрабатывали 3 и 5 мМ PPA в течение 24 часов. Относительную количественную оценку генов проводили с использованием RT-qPCR и нормировали по B2M. Гены митохондриального биогенеза: (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 и (d) NFE2L2. Гены слияния и деления митохондрий: (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 и (i) DRP1. Значимые различия (p < 0,05) проверяли с помощью однофакторного дисперсионного анализа (контроль против обработки) и множественного сравнения по Даннетту: * указывает на p < 0,05, ** указывает на p < 0,01, и **** указывает на p < 0,0001. На графиках представлены средние значения экспрессии ± стандартная ошибка среднего. Представленные данные соответствуют n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2) и n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) биологическим повторам.
Данные, полученные с помощью трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ) и микроскопии с использованием микроэлектродов (МЭЛ), в совокупности указывают на то, что PPA изменяет морфологию и динамику митохондрий. Однако эти методы визуализации не позволяют понять основные механизмы, лежащие в основе этих процессов. Поэтому мы исследовали экспрессию мРНК девяти ключевых регуляторов динамики, биогенеза и митоза митохондрий в ответ на обработку PPA. Мы количественно оценили онкоген миеломы клеток (cMYC), ядерный респираторный фактор (NRF1), митохондриальный транскрипционный фактор 1 (TFAM), транскрипционный фактор BZIP, подобный NFE2 (NFE2L2), гастрин-подобный белок 2 (STOML2), белок атрофии зрительного нерва 1 (OPA1), митофузин 1 (MFN1), митофузин 2 (MFN2) и динамин-связанный белок 1 (DRP1) после 24 часов обработки 3 мМ и 5 мМ PPA. Мы наблюдали эффекты обработки PPA при концентрациях 3 мМ (p = 0,0053, p = 0,0415 и p < 0,0001 соответственно) и 5 ​​мМ (p = 0,0031, p = 0,0233, p < 0,0001) (рис. 3a–c). Снижение экспрессии мРНК было дозозависимым: экспрессия cMYC, NRF1 и TFAM снизилась в 5,7, 2,6 и 1,9 раза при 3 мМ соответственно, и в 11,2, 3 и 2,2 раза при 5 мМ. В отличие от этого, экспрессия центрального гена биогенеза окислительно-восстановительных процессов NFE2L2 не изменялась ни при одной концентрации PPA, хотя наблюдалась аналогичная дозозависимая тенденция снижения экспрессии (рис. 3d).
Мы также исследовали экспрессию классических генов, участвующих в регуляции деления и слияния. Считается, что STOML2 участвует в слиянии, митофагии и биогенезе, и его экспрессия была значительно снижена (p < 0,0001) при концентрации PPA 3 мМ (2,4-кратное изменение) и 5 ​​мМ (2,8-кратное изменение) (рис. 1). 3d). Аналогично, экспрессия гена слияния OPA1 снижалась при концентрации PPA 3 мМ (1,6-кратное изменение) и 5 ​​мМ (1,9-кратное изменение) (p = 0,006 и p = 0,0024 соответственно) (рис. 3f). Однако мы не обнаружили существенных различий в экспрессии генов слияния MFN1, MFN2 или гена деления DRP1 при 24-часовом стрессе PPA (рис. 3g–i). Кроме того, мы обнаружили, что уровни четырех белков слияния и деления (OPA1, MFN1, MFN2 и DRP1) не изменялись в тех же условиях (рис. 4a–d). Важно отметить, что эти данные отражают ситуацию в один момент времени и могут не отражать изменения в экспрессии или активности белков на ранних стадиях стресса, вызванного PPA. Однако значительное снижение экспрессии cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 и OPA1 указывает на значительную транскрипционную дисрегуляцию митохондриального метаболизма, биогенеза и динамики. Кроме того, эти данные подчеркивают полезность методов визуализации для непосредственного изучения изменений конечного состояния митохондриальной функции.
Уровни белков факторов слияния и деления не изменились после обработки пропионовой кислотой (PPA). Клетки SH-SY5Y обрабатывали 3 и 5 мМ PPA в течение 24 часов. Уровни белков количественно определяли методом вестерн-блоттинга, а уровни экспрессии нормализовали относительно общего белка. Показаны средние уровни экспрессии белка и репрезентативные вестерн-блоты целевого и общего белка. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. Столбики представляют среднее значение ± стандартная ошибка среднего, и представленные данные являются репрезентативными для n = 3 биологических повторов. Множественные сравнения (p < 0,05) проводили с использованием однофакторного дисперсионного анализа и теста Даннетта. Оригинальный гель и блот показаны на рисунке S1.
Дисфункция митохондрий связана с мультисистемными заболеваниями, начиная от метаболических, сердечно-сосудистых и мышечных заболеваний и заканчивая неврологическими заболеваниями1,10. Многие нейродегенеративные и нейродегенеративные заболевания связаны с дисфункцией митохондрий, что подчеркивает важность этих органелл на протяжении всей жизни головного мозга. К таким заболеваниям относятся болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера и расстройства аутистического спектра (РАС)3,4,18. Однако доступ к тканям головного мозга для изучения этих заболеваний затруднен, особенно на механистическом уровне, что делает клеточные модельные системы необходимой альтернативой. В этом исследовании мы используем клеточную модельную систему на основе клеток SH-SY5Y, обработанных PPA, чтобы воспроизвести дисфункцию митохондрий, наблюдаемую при нейрональных заболеваниях, в частности, расстройствах аутистического спектра. Использование этой модели PPA для изучения динамики митохондрий в нейронах может дать представление об этиологии РАС.
Мы исследовали возможность использования ТЭМ для наблюдения за изменениями морфологии митохондрий. Важно отметить, что для максимальной эффективности ТЭМ необходимо использовать правильно. Подготовка криообразцов позволяет лучше сохранять нейронные структуры за счет одновременной фиксации клеточных компонентов и уменьшения образования артефактов34. В соответствии с этим, мы наблюдали, что нейроноподобные клетки SH-SY5Y имели неповрежденные субклеточные органеллы и удлиненные митохондрии (рис. 1а). Это подчеркивает полезность криогенных методов подготовки для изучения морфологии митохондрий в моделях нейронных клеток. Хотя количественные измерения имеют решающее значение для объективного анализа данных ТЭМ, до сих пор нет единого мнения о том, какие конкретные параметры следует измерять для подтверждения изменений морфологии митохондрий. На основе большого количества исследований, в которых количественно изучалась морфология митохондрий17,31,32, мы разработали автоматизированный конвейер анализа изображений митохондрий, измеряющий восемь морфологических параметров, а именно: площадь, площадь2, соотношение сторон, периметр, округлость, степень, диаметр Феррета и округлость.
Среди них PPA значительно уменьшил площадь 2, площадь, периметр и диаметр Ферета (рис. 1b–e). Это показало, что митохондрии стали меньше и более округлыми, что согласуется с предыдущими исследованиями, демонстрирующими уменьшение площади митохондрий после 72 часов митохондриального стресса, вызванного PPA30. Эти морфологические особенности могут указывать на митохондриальное деление, необходимый процесс для изоляции поврежденных компонентов от митохондриальной сети с целью содействия их деградации посредством митофагии35,36,37. С другой стороны, уменьшение среднего размера митохондрий может быть связано с усилением биогенеза, что приводит к образованию небольших зарождающихся митохондрий. Усиление деления или биогенеза представляет собой компенсаторную реакцию для поддержания митоза в условиях митохондриального стресса. Однако нельзя исключить снижение роста митохондрий, нарушение слияния или другие состояния.
Хотя изображения высокого разрешения, полученные с помощью ТЭМ, позволяют определять морфологические характеристики на уровне отдельных митохондрий, этот метод создает двухмерные снимки в один момент времени. Для изучения динамических реакций на метаболический стресс мы окрашивали митохондрии TMRE и использовали покадровую микроскопию с анализом MEL, что позволяет проводить высокопроизводительную трехмерную визуализацию изменений в митохондриальной сети во времени33,38. Мы наблюдали тонкие, но значительные изменения в динамике митохондрий при стрессе, вызванном PPA (рис. 2). При концентрации 3 мМ количество событий деления значительно увеличилось, в то время как количество событий слияния осталось таким же, как и в контроле. Увеличение количества как событий деления, так и событий слияния наблюдалось при концентрации PPA 5 мМ, но эти изменения были приблизительно пропорциональны, что предполагает, что кинетика деления и слияния достигает равновесия при более высоких концентрациях (рис. 2b). Средний объем митохондрий оставался неизменным как при 3, так и при 5 мМ PPA, что указывает на сохранение целостности митохондриальной сети (рис. 2d). Это отражает способность динамических митохондриальных сетей реагировать на умеренный метаболический стресс, эффективно поддерживая гомеостаз без фрагментации сети. При 3 мМ PPA увеличение деления достаточно для перехода к новому равновесию, но для более глубокой кинетической перестройки требуется более выраженная ремоделизация в ответ на стресс, вызванный более высокими концентрациями PPA.
Количество митохондрий увеличилось при обеих концентрациях стрессового воздействия PPA, но средний объем митохондрий существенно не изменился (рис. 2c). Это может быть связано с усилением биогенеза или деления; однако, при отсутствии значительного уменьшения среднего объема митохондрий, более вероятно, что увеличивается биосинтез. Тем не менее, данные на рисунке 2 подтверждают существование двух компенсаторных механизмов: увеличение числа событий деления, что согласуется с усилением митохондриального деления, и увеличение числа событий, что согласуется с митохондриальным биогенезом. В конечном итоге, динамическая компенсация при умеренном стрессе может состоять из одновременных процессов, включающих деление, слияние, биогенез и митофагию. Хотя предыдущие авторы показали, что PPA усиливает митоз30,39 и митофагию29, мы предоставляем доказательства ремоделирования динамики митохондриального деления и слияния в ответ на PPA. Эти данные подтверждают морфологические изменения, наблюдаемые с помощью трансмиссионной электронной микроскопии, и позволяют глубже понять механизмы, связанные с митохондриальной дисфункцией, вызванной PPA.
Поскольку ни анализ с помощью трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ), ни анализ с помощью микроэлектрофореза (МЭЛ) не предоставили прямых доказательств механизмов регуляции генов, лежащих в основе наблюдаемых морфологических изменений, мы исследовали экспрессию РНК генов, участвующих в митохондриальном метаболизме, биогенезе и динамике. Протоонкоген cMYC является фактором транскрипции, участвующим в регуляции митохондрий, гликолиза, метаболизма аминокислот и жирных кислот40. Кроме того, известно, что cMYC регулирует экспрессию почти 600 митохондриальных генов, участвующих в митохондриальной транскрипции, трансляции и сборке комплексов, включая NRF1 и TFAM41. NRF1 и TFAM являются двумя центральными регуляторами митоза, действующими ниже по течению от PGC-1α для активации репликации мтДНК. Этот путь активируется сигнальными путями cAMP и AMPK и чувствителен к расходу энергии и метаболическому стрессу. Мы также исследовали NFE2L2, регулятор окислительно-восстановительного баланса митохондриального биогенеза, чтобы определить, могут ли эффекты PPA быть опосредованы окислительным стрессом.
Хотя экспрессия NFE2L2 оставалась неизменной, мы обнаружили устойчивое дозозависимое снижение экспрессии cMYC, NRF1 и TFAM после 24 часов обработки 3 мМ и 5 мМ PPA (рис. 3a–c). Ранее сообщалось о снижении экспрессии cMYC в ответ на митохондриальный стресс42, и наоборот, снижение экспрессии cMYC может вызывать митохондриальную дисфункцию путем ремоделирования митохондриального метаболизма, сетевой связности и поляризации мембран43. Интересно, что cMYC также участвует в регуляции митохондриального деления и слияния42,43 и, как известно, увеличивает фосфорилирование DRP1 и митохондриальную локализацию во время деления клеток44, а также опосредует морфологическое ремоделирование митохондрий в нейрональных стволовых клетках45. Действительно, фибробласты с дефицитом cMYC демонстрируют уменьшение размера митохондрий, что согласуется с изменениями, вызванными стрессом PPA43. Эти данные иллюстрируют интересную, но пока неясную взаимосвязь между cMYC и динамикой митохондрий, предоставляя интересную мишень для будущих исследований ремоделирования, вызванного стрессом PPA.
Снижение уровней NRF1 и TFAM согласуется с ролью cMYC как важного транскрипционного активатора. Эти данные также согласуются с предыдущими исследованиями на клетках рака толстой кишки человека, показавшими, что PPA снижает экспрессию мРНК NRF1 через 22 часа, что было связано с истощением АТФ и увеличением ROS46. Эти авторы также сообщили, что экспрессия TFAM увеличивалась через 8,5 часов, но возвращалась к исходному уровню через 22 часа. В отличие от этого, Ким и др. (2019) показали, что экспрессия мРНК TFAM значительно снижалась после 4 часов стресса PPA в клетках SH-SY5Y; однако через 72 часа экспрессия белка TFAM значительно увеличивалась, а количество копий мтДНК значительно возрастало. Таким образом, снижение количества генов митохондриального биогенеза, которое мы наблюдали через 24 часа, не исключает возможности того, что увеличение количества митохондрий связано с активацией биогенеза на более ранних этапах. Предыдущие исследования показали, что PPA значительно повышает уровень мРНК и белка PGC-1α в клетках SH-SY5Y через 4 часа 30 минут, в то время как пропионовая кислота усиливает митохондриальный биогенез в гепатоцитах теленка через PGC-1α через 12 часов 39 минут. Интересно, что PGC-1α является не только прямым транскрипционным регулятором NRF1 и TFAM, но также, как было показано, регулирует активность MFN2 и DRP1, регулируя деление и слияние47. В совокупности это подчеркивает тесную взаимосвязь механизмов, регулирующих митохондриальные компенсаторные реакции, индуцированные PPA. Более того, наши данные отражают значительную дисрегуляцию транскрипционной регуляции биогенеза и метаболизма в условиях стресса, вызванного PPA.
Гены STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 и DRP1 входят в число центральных регуляторов деления, слияния и динамики митохондрий37,48,49. Существует множество других генов, участвующих в динамике митохондрий, однако ранее было обнаружено, что STOML2, OPA1 и MFN2 имеют дифференциальный метилированный статус в когортах лиц с РАС16, и несколько независимых исследований сообщили об изменениях этих транскрипционных факторов в ответ на митохондриальный стресс50,51. 52. Экспрессия как OPA1, так и STOML2 значительно снижалась при обработке 3 мМ и 5 мМ PPA (рис. 3e, f). OPA1 является одним из классических регуляторов слияния митохондрий посредством прямого взаимодействия с MFN1 и 2 и играет роль в ремоделировании крист и морфологии митохондрий53. Точная роль STOML2 в динамике митохондрий остается неясной, но имеющиеся данные свидетельствуют о том, что он играет роль в слиянии митохондрий, биогенезе и митофагии.
STOML2 участвует в поддержании митохондриального дыхательного сопряжения и формировании комплексов дыхательной цепи54,55, и, как было показано, существенно изменяет метаболические характеристики раковых клеток56. Исследования показали, что STOML2 способствует митохондриальному мембранному потенциалу и биогенезу посредством взаимодействия с BAN и кардиолипином55, 57, 58. Кроме того, независимые исследования показали, что взаимодействие между STOML2 и PINK1 регулирует митофагию59,60. Примечательно, что STOML2, как сообщается, непосредственно взаимодействует с MFN2 и стабилизирует его, а также играет важную роль в стабилизации длинных изоформ OPA1, ингибируя протеазу, ответственную за деградацию OPA153,61,62. Снижение экспрессии STOML2, наблюдаемое в реакциях PPA, может сделать эти гибридные белки более восприимчивыми к деградации через убиквитин- и протеасом-зависимые пути48. Хотя точная роль STOML2 и OPA1 в динамическом ответе на PPA неясна, снижение экспрессии этих генов слияния (рис. 3) может нарушить баланс между делением и слиянием и привести к уменьшению размера митохондрий (рис. 3). 1).
С другой стороны, экспрессия белка OPA1 оставалась неизменной через 24 часа, в то время как уровни мРНК и белка MFN1, MFN2 или DRP1 существенно не изменились после обработки PPA (рис. 3g-i, рис. 4). Это может указывать на отсутствие изменений в регуляции этих факторов, участвующих в слиянии и делении митохондрий. Однако стоит отметить, что каждый из этих четырех генов также регулируется посттранскрипционными модификациями (ПТМ), которые контролируют активность белка. OPA1 имеет восемь альтернативных вариантов сплайсинга, которые протеолитически расщепляются в митохондриях, образуя две различные изоформы 63. Баланс между длинными и короткими изоформами в конечном итоге определяет роль OPA1 в слиянии митохондрий и поддержании митохондриальной сети64. Активность DRP1 регулируется фосфорилированием кальций/кальмодулин-зависимой протеинкиназой II (CaMKII), тогда как деградация DRP1 регулируется убиквитинированием и SUMOилированием65. Наконец, как DRP1, так и MFN1/2 являются ГТФазами, поэтому на их активность может влиять скорость образования ГТФ в митохондриях66. Следовательно, хотя экспрессия этих белков остается постоянной, это может не отражать неизменную активность или локализацию белков67,68. Действительно, существующие репертуары белков, подвергшихся посттрансляционной модификации (ПТМ), часто служат первой линией защиты, ответственной за опосредование острых стрессовых реакций. В присутствии умеренного метаболического стресса в нашей модели вероятно, что ПТМ способствует повышению активности белков слияния и деления для достаточного восстановления целостности митохондрий без необходимости дополнительной активации этих генов на уровне мРНК или белка.
В совокупности приведенные выше данные подчеркивают сложную и зависящую от времени регуляцию морфологии митохондрий и сложности выяснения этих механизмов. Для изучения экспрессии генов сначала необходимо идентифицировать специфические целевые гены в сигнальном пути. Однако наши данные показывают, что гены в одном и том же сигнальном пути реагируют по-разному на один и тот же стресс. В самом деле, предыдущие исследования показали, что разные гены в одном и том же сигнальном пути могут демонстрировать разные временные профили ответа30,46. Кроме того, существуют сложные посттранскрипционные механизмы, которые нарушают связь между транскрипцией и функцией гена. Протеомные исследования могут дать представление о влиянии посттрансляционных модификаций на функцию белка, но они также сопряжены с трудностями, включая низкую пропускную способность методов, высокое отношение сигнал/шум и низкое разрешение.
В этом контексте изучение морфологии митохондрий с помощью ТЭМ и МЭЛ имеет большой потенциал для решения фундаментальных вопросов о взаимосвязи между динамикой и функцией митохондрий и о том, как это влияет на заболевания. Что наиболее важно, ТЭМ предоставляет прямой метод измерения морфологии митохондрий как конвергентного показателя митохондриальной дисфункции и динамики51. МЭЛ также предоставляет прямой метод визуализации событий деления и слияния в трехмерной клеточной среде, позволяя количественно оценить динамическое ремоделирование митохондрий даже в отсутствие изменений в экспрессии генов33. Здесь мы подчеркиваем полезность методов визуализации митохондрий при вторичных митохондриальных заболеваниях. Эти заболевания обычно характеризуются хроническим умеренным метаболическим стрессом, характеризующимся незначительным ремоделированием митохондриальных сетей, а не острым повреждением митохондрий. Однако митохондриальная компенсация, необходимая для поддержания митоза в условиях хронического стресса, имеет серьезные функциональные последствия. В контексте нейронауки, лучшее понимание этих компенсаторных механизмов может предоставить важную информацию о плейотропной нейропатологии, связанной с митохондриальной дисфункцией.
В конечном итоге, наши данные подчеркивают полезность методов визуализации для понимания функциональных последствий сложных взаимодействий между экспрессией генов, модификациями белков и активностью белков, которые контролируют динамику митохондрий нейронов. Мы использовали PPA для моделирования митохондриальной дисфункции в модели нейронной клетки, чтобы получить представление о митохондриальном компоненте РАС. Клетки SH-SY5Y, обработанные PPA, показали изменения в морфологии митохондрий: митохондрии стали маленькими и круглыми, а кристы были плохо различимы при наблюдении с помощью ТЭМ. Анализ MEL показывает, что эти изменения происходят одновременно с увеличением числа событий деления и слияния для поддержания митохондриальной сети в ответ на умеренный метаболический стресс. Более того, PPA значительно нарушает транскрипционную регуляцию митохондриального метаболизма и гомеостаза. Мы идентифицировали cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 и OPA1 как ключевые митохондриальные регуляторы, активность которых нарушается под воздействием стресса, вызванного PPA, и которые могут играть роль в опосредовании изменений морфологии и функции митохондрий, вызванных PPA. Необходимы дальнейшие исследования для более точной характеристики временных изменений экспрессии генов и активности белков, их локализации и посттрансляционных модификаций, вызванных PPA. Наши данные подчеркивают сложность и взаимозависимость регуляторных механизмов, опосредующих реакцию митохондрий на стресс, и демонстрируют полезность трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ) и других методов визуализации для более целенаправленных механистических исследований.
Клеточная линия SH-SY5Y (ECACC, 94030304-1VL) была приобретена у компании Sigma-Aldrich. Клетки SH-SY5Y выращивали в модифицированной среде Дульбекко/питательной смеси F-12 (DMEM/F-12) с добавлением L-глутамина (SC09411, ScienCell) в колбах объемом 25 см2, дополненных 20% фетальной бычьей сывороткой (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) и 1% пенициллином-стрептомицином (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) при температуре 37 °C и 5% CO2. Клетки культивировали до достижения 80% конфлюенции с использованием 0,05% трипсина-ЭДТА (15400054, ThermoFisher Scientific), центрифугировали при 300 g и высевали с плотностью приблизительно 7 × 10⁵ клеток/мл. Все эксперименты проводили на недифференцированных клетках SH-SY5Y в диапазоне пассажей 19–22. PPA вводили в виде NaP. Растворите порошок NaP (CAS № 137-40-6, химическая формула C3H5NaO₂, P5436-100G, Sigma-Aldrich) в теплой воде MilliQ до концентрации 1 М и храните при 4 °C. В день обработки разбавьте этот раствор 1 М PPA до концентраций 3 мМ и 5 мМ PPA в бессывороточной среде (DMEM/F-12 с L-глутамином). В качестве концентраций для всех экспериментов использовались: отсутствие ППА (0 мМ, контроль), 3 мМ и 5 мМ ППА. Эксперименты проводились как минимум в трех биологических повторах.
Клетки SH-SY5Y высевали в колбы объемом 25 см5 со скоростью 5,5 × 10⁵ клеток/мл и культивировали в течение 24 часов. Обработка PPA проводилась в колбе за 24 часа до начала инкубации. Клеточные осадки собирали в соответствии с обычными протоколами субкультивирования тканей млекопитающих (описанными выше). Клеточный осадок ресуспендировали в 100 мкл 2,5% раствора глутаральдегида в 1× PBS и хранили при 4 °C до обработки. Клетки SH-SY5Y кратковременно центрифугировали для осаждения клеток и удаления 2,5% раствора глутаральдегида в 1× PBS. Осадок ресуспендировали в 4% агарозном геле, приготовленном в дистиллированной воде (соотношение объема агарозы к объему осадка 1:1). Кусочки агарозы помещали на сетки на плоских пластинах и покрывали 1-гексадеценом перед высокоскоростной заморозкой. Образцы замораживали в 100% сухом ацетоне при -90°C в течение 24 часов. Затем температуру повышали до -80°C и добавляли раствор 1% тетраоксида осмия и 0,1% глутарового альдегида. Образцы хранили при -80°C в течение 24 часов. После этого температуру постепенно повышали до комнатной температуры в течение нескольких дней: от –80°C до –50°C в течение 24 часов, до –30°C в течение 24 часов, до –10°C в течение 24 часов и, наконец, до комнатной температуры.
После криогенной обработки образцы пропитывали смолой, и с помощью ультрамикротома Leica Reichert UltracutS (Leica Microsystems) изготавливали ультратонкие срезы (∼100 нм). Срезы окрашивали 2%-ным раствором ацетата уранила и цитратом свинца. Образцы исследовали с помощью просвечивающего электронного микроскопа FEI Tecnai 20 (ThermoFisher (ранее FEI), Эйндховен, Нидерланды), работающего при напряжении 200 кВ (передатчик Lab6), и ПЗС-камеры Gatan (Gatan, Великобритания), оснащенной энергетическим фильтром Tridiem.
В каждой технической реплике было получено не менее 24 изображений отдельных клеток, всего 266 изображений. Все изображения анализировались с помощью макроса «Область интереса» (ROI) и макроса «Митохондрии». Макрос митохондрий основан на опубликованных методах17,31,32 и позволяет осуществлять полуавтоматическую пакетную обработку изображений TEM в Fiji/ImageJ69. Вкратце: изображение инвертируется с использованием вычитания фона методом «катящегося шара» (радиус 60 пикселей) и полосового фильтра БПФ (с использованием верхних и нижних границ 60 и 8 пикселей соответственно), а также подавления вертикальных линий с допуском по ориентации 5%. Обработанное изображение автоматически подвергается пороговой обработке с использованием алгоритма максимальной энтропии, и генерируется бинарная маска. Области изображения, связанные с вручную выбранными ROI в исходных изображениях TEM, были извлечены, характеризуя митохондрии и исключая плазматическую мембрану и другие высококонтрастные области. Для каждой выделенной области интереса (ROI) анализировались бинарные частицы размером более 600 пикселей, а площадь частицы, периметр, большая и малая оси, диаметр Феррета, округлость и круглость измерялись с помощью встроенных функций измерения Fiji/ImageJ. В соответствии с методикой Меррилла, Флиппо и Страка (2017) из этих данных рассчитывались площадь 2, соотношение сторон частицы (отношение большой оси к малой оси) и коэффициент формы (FF), где FF = периметр 2/4π × площадь. Определение параметрической формулы можно найти в работе Меррилла, Флиппо и Страка (2017). Упомянутые макросы доступны на GitHub (см. Заявление о доступности данных). В среднем, для каждого варианта обработки PPA анализировалось приблизительно 5600 частиц, всего около 17000 частиц (данные не показаны).
Клетки SH-SH5Y помещали в 8-камерные культуральные чашки (ThermoFisher, #155411) для адгезии в течение ночи, а затем инкубировали с красителями TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) и Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024). Изображения получали с использованием лазеров с длиной волны 405 нм и 561 нм в течение 10 минут, а необработанные изображения получали в виде Z-стеков, содержащих 10 микрофотографий с шагом по оси азимута 0,2 мкм между кадрами изображения в 12 последовательных временных точках. Изображения собирали с помощью платформы сверхвысокого разрешения Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 (Carl Zeiss, Оберкохен, Германия) с использованием объектива LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27. Изображения анализировались в ImageJ с использованием ранее описанного алгоритма и плагина ImageJ для измерения событий слияния и деления, среднего числа митохондриальных структур и среднего объема митохондрий на клетку33. Макросы MEL доступны на GitHub (см. Заявление о доступности данных).
Клетки SH-SY5Y выращивали в шестилуночных планшетах при плотности 0,3 × 10⁶ клеток/мл в течение 24 часов перед обработкой. РНК экстрагировали с использованием протокола Quick-RNA™ Miniprep (ZR R1055, Zymo Research) с небольшими модификациями: в каждую лунку добавляли 300 мкл буфера для лизиса РНК перед удалением и проводили лизис каждого образца на заключительном этапе с помощью 30 мкл элюата ДНКазы/РНКазы. Все образцы проверяли на количество и качество с помощью УФ-спектрофотометра NanoDrop ND-1000. Общий белок из клеточных лизатов получали с использованием 200 мкл буфера для лизиса RIPA, а концентрацию белка определяли с помощью анализа белка по Брэдфорду⁷⁰.
Синтез кДНК проводили с использованием набора для синтеза кДНК Tetro™ (BIO-65043, Meridian Bioscience) в соответствии с инструкциями производителя с некоторыми модификациями. Синтез кДНК осуществляли в реакциях объемом 20 мкл, используя от 0,7 до 1 мкг общей РНК. Праймеры были выбраны из ранее опубликованных работ 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (таблица S1), а соответствующие зонды были разработаны с помощью инструмента PrimerQuest от Integrated DNA Technologies. Все интересующие гены были нормализованы относительно ядерного гена B2M. Экспрессию генов STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC и OPA1 измеряли методом ОТ-ПЦР. В состав мастер-микса входили Taq-полимераза LUNA (M3003L, New England Biolabs), 10 мкМ прямых и обратных праймеров, кДНК и вода для ПЦР, что обеспечивало конечный объем 10 мкл для каждой реакции. Экспрессию генов деления и расщепления (DRP1, MFN1/2) измеряли с помощью мультиплексных анализов TaqMan. Мастер-микс Luna Universal Probe qPCR (M3004S, New England Biolabs) использовали в соответствии с инструкциями производителя с небольшими изменениями. Мастер-микс для мультиплексной ОТ-ПЦР включает 1X Taq-полимеразу LUNA, 10 мкМ прямых и обратных праймеров, 10 мкМ зонда, кДНК и воду для ПЦР, что обеспечивало конечный объем 20 мкл для каждой реакции. RT-qPCR проводили с использованием Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG — серийный номер: R0618110). Условия циклической амплификации приведены в таблице S1. Все образцы кДНК амплифицировали в трех повторах, и стандартную кривую строили с использованием серии десятикратных разведений. Выбросы в трех повторах с пороговым стандартным отклонением цикла (Ct) >0,5 были удалены из анализа для обеспечения воспроизводимости данных30,72. Относительную экспрессию генов рассчитывали с использованием метода 2-ΔΔCt79.
Образцы белка (60 мкг) смешивали с буфером для нанесения образцов по Леммли в соотношении 2:1 и разделяли на 12% бесцветном белковом геле (Bio-Rad #1610184). Белки переносили на ПВДФ (поливинилиденфторидную) мембрану (#170-84156, Bio-Rad) с помощью системы Trans-Blot Turbo (#170-4155, Bio-Rad). Мембрану блокировали и инкубировали с соответствующими первичными антителами (OPA1, MFN1, MFN2 и DRP1) (разведение 1:1000) в течение 48 часов, после чего инкубировали со вторичными антителами (1:10 000) в течение 1 часа. Затем мембраны визуализировали с использованием субстрата Clarity Western ECL (#170-5061, Bio-Rad) и регистрировали с помощью системы Bio-Rad ChemiDoc MP. Для анализа методом вестерн-блоттинга использовалась программа ImageLab версии 6.1. Исходный гель и блот показаны на рисунке S1. Информация об антителах представлена ​​в таблице S2.
Данные представлены в виде среднего значения и стандартной ошибки среднего (SEM) как минимум трех независимых выборок. Перед проведением анализа данные проверялись на нормальность распределения с помощью теста Шапиро-Уилкса (если не указано иное). Кроме того, для определения значимости использовались критерий Фишера MEL LSD (p < 0,05), однофакторный дисперсионный анализ (среднее значение в группе лечения против контрольной группы) и множественный сравнительный тест Даннетта (p < 0,05). Значимые значения p показаны на графике как *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Все статистические анализы и графики были выполнены и построены с помощью GraphPad Prism 9.4.0.
Макросы Fiji/ImageJ для анализа изображений TEM доступны на GitHub: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. Макрос Mitochondrial Event Locator (MEL) также доступен на GitHub: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
Мейлиана А., Деви Н.М. и Виджая А. Митохондрии: главные регуляторы метаболизма, гомеостаза, стресса, старения и эпигенетики. Индонезийский журнал биомедицинской науки. Журнал 13, 221–241 (2021).
Бен-Шахар, Д. Многогранная митохондриальная дисфункция при шизофрении, комплекс I как возможная патологическая мишень. Шизофрения. ресурс. 187, 3–10 (2017).
Бозе, А. и Бил, М.Ф. Митохондриальная дисфункция при болезни Паркинсона. Журнал нейрохимии. 139, 216–231 (2016).
Шарма ВК, Сингх ТГ и Мехта В. Стрессовые митохондрии: мишени инвазии при болезни Альцгеймера. Митохондрии 59, 48–57 (2021).
Беленгер П., Дуарте Дж.М.Н., Шук П.Ф. и Феррейра Г.К. Митохондрии и мозг: биоэнергетика и многое другое. Нейротоксины. ресурс. 36, 219–238 (2019).
Рангараджу, В. и др. Плейотропные митохондрии: влияние митохондрий на развитие нейронов и заболевания. Журнал нейронауки. 39, 8200–8208 (2019).
Карданьо-Рамос, К. и Мораис, В.А. Митохондриальный биогенез в нейронах: как и где. Internationality. J. Mohr. The Science. 22, 13059 (2021).
Ю, Р., Лендаль, У., Нистер, М. и Чжао, Дж. Регуляция динамики митохондрий млекопитающих: возможности и проблемы. Front. Endocrine. (Лозанна) 11, 374 (2020).
Хачо, М. и Слэк, Р.С. Динамика митохондрий в регуляции нейрогенеза: от развивающегося до взрослого мозга. Развитие. Динамика. 247, 47–53 (2018).