Благодарим вас за посещение сайта Nature.com. Версия вашего браузера имеет ограниченную поддержку CSS. Для наилучшего взаимодействия с сайтом мы рекомендуем использовать обновленную версию браузера (или отключить режим совместимости в Internet Explorer). В настоящее время, для обеспечения дальнейшей поддержки, мы будем отображать сайт без стилей и JavaScript.
Наночастицы инсулина (НП) с высоким содержанием нагруженного вещества нашли различное применение в разных лекарственных формах. Цель данной работы — оценить влияние процессов лиофилизации и распылительной сушки на структуру нагруженных инсулином хитозановых наночастиц с маннитолом в качестве криопротектора или без него. Мы также оценили качество этих наночастиц путем их повторного растворения. Перед дегидратацией размер частиц сшитых наночастиц хитозан/триполифосфат натрия/инсулин был оптимизирован до 318 нм, индекс полидисперсности (PDI) составил 0,18, эффективность инкапсуляции — 99,4%, а загрузка — 25,01%. После восстановления все наночастицы, за исключением тех, которые были получены методом лиофилизации без использования маннитола, сохранили свою сферическую структуру. По сравнению с маннитолсодержащими наночастицами, дегидратированными методом распылительной сушки, наночастицы, полученные методом распылительной сушки без маннитола, Также были получены наименьшее среднее значение размера частиц (376 нм) и наибольшее содержание загрузки (25,02%) при аналогичной степени инкапсуляции (98,7%) и индексе полидисперсности (PDI) (0,20) при использовании методов сушки или лиофилизации. Высушенные распылительными сушками наночастицы без маннитола также обеспечили самое быстрое высвобождение инсулина и самую высокую эффективность клеточного поглощения. Эта работа показывает, что распылительная сушка позволяет обезвоживать наночастицы инсулина без необходимости использования криопротекторов по сравнению с традиционными методами лиофилизации, обеспечивая большую загрузочную способность, меньшие требования к добавкам и значительные эксплуатационные расходы.
С момента своего открытия в 1922 году1,2,3 инсулин и его фармацевтические препараты спасают жизни пациентов с диабетом 1-го типа (Д1) и диабетом 2-го типа (Д1). Однако, благодаря своим свойствам высокомолекулярного белка, инсулин легко агрегируется, расщепляется протеолитическими ферментами и выводится через печень. Людям с диагнозом диабет 1-го типа необходимы инъекции инсулина на протяжении всей жизни. Многим пациентам с первоначальным диагнозом диабета 2-го типа также требуются длительные инъекции инсулина. Ежедневные инъекции инсулина являются серьезным источником ежедневной боли и дискомфорта для этих людей, что негативно сказывается на психическом здоровье. В результате активно изучаются другие формы введения инсулина, вызывающие меньший дискомфорт, такие как пероральный прием инсулина5, поскольку они потенциально могут восстановить качество жизни примерно 5 миллиардов человек с диабетом во всем мире.
Технология наночастиц значительно продвинула попытки перорального приема инсулина4,6,7. Она позволяет эффективно инкапсулировать инсулин и защищать его от деградации для адресной доставки в определенные участки тела. Однако использование наночастиц имеет ряд ограничений, главным образом из-за проблем со стабильностью суспензий частиц. Во время хранения может происходить некоторая агрегация, что снижает биодоступность наночастиц, содержащих инсулин8. Кроме того, для обеспечения стабильности инсулиновых наночастиц (НП) необходимо также учитывать химическую стабильность полимерной матрицы наночастиц и инсулина. В настоящее время технология лиофилизации является золотым стандартом для создания стабильных НП, предотвращающим нежелательные изменения во время хранения9.
Однако лиофилизация требует добавления криопротекторов для предотвращения повреждения сферической структуры наночастиц под воздействием механического напряжения кристаллов льда. Это значительно снижает загрузку инсулиновых наночастиц после лиофилизации, поскольку криопротектор занимает большую часть весового соотношения. Поэтому полученные инсулиновые наночастицы часто оказываются непригодными для производства сухих порошковых лекарственных форм, таких как таблетки и пленки для приема внутрь, из-за необходимости больших объемов сухих наночастиц для достижения терапевтического окна инсулина.
Распылительная сушка — это хорошо известный и недорогой промышленный процесс получения сухих порошков из жидких фаз в фармацевтической промышленности10,11. Контроль над процессом образования частиц позволяет обеспечить надлежащую инкапсуляцию нескольких биоактивных соединений12,13. Кроме того, она стала эффективным методом для приготовления инкапсулированных белков для перорального применения. Во время распылительной сушки вода испаряется очень быстро, что помогает поддерживать низкую температуру ядра частицы11,14, что позволяет использовать ее для инкапсуляции термочувствительных компонентов. Перед распылительной сушкой материал покрытия должен быть тщательно гомогенизирован с раствором, содержащим инкапсулированные ингредиенты11,14. В отличие от лиофилизации, гомогенизация перед инкапсуляцией при распылительной сушке повышает эффективность инкапсуляции во время дегидратации. Поскольку процесс инкапсуляции методом распылительной сушки не требует криопротекторов, распылительная сушка может быть использована для получения сухих наночастиц с высоким содержанием загрузки.
В данном исследовании описывается получение наночастиц, нагруженных инсулином, путем сшивания хитозана и триполифосфата натрия с использованием метода ионного геля. Ионное гелеобразование — это метод получения наночастиц, позволяющий получать наночастицы посредством электростатического взаимодействия между двумя или более ионными частицами при определенных условиях. Для обезвоживания оптимизированных сшитых наночастиц хитозан/триполифосфат натрия/инсулин использовались методы лиофилизации и распылительной сушки. После обезвоживания их морфология анализировалась с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ). Способность к рекомбинации оценивалась путем измерения распределения по размерам, поверхностного заряда, индекса полидисперсности (PDI), эффективности инкапсуляции и содержания наночастиц. Качество рерастворенных наночастиц, полученных различными методами обезвоживания, также оценивалось путем сравнения их способности защищать инсулин, поведения при высвобождении и эффективности клеточного поглощения.
pH смешанного раствора и соотношение хитозана и инсулина являются двумя ключевыми факторами, влияющими на размер частиц и эффективность инкапсуляции (ЭИ) конечных наночастиц, поскольку они напрямую влияют на процесс ионотропного гелеобразования. Было показано, что pH смешанного раствора сильно коррелирует с размером частиц и эффективностью инкапсуляции (рис. 1а). Как показано на рис. 1а, при увеличении pH от 4,0 до 6,0 средний размер частиц (нм) уменьшался, а ЭИ значительно увеличивалась, в то время как при увеличении pH до 6,5 средний размер частиц начинал увеличиваться, а ЭИ оставалась неизменной. По мере увеличения соотношения хитозана к инсулину средний размер частиц также увеличивается. Кроме того, изменений в ЭИ не наблюдалось, когда наночастицы готовили при массовом соотношении хитозана/инсулина выше 2,5:1 (вес/вес) (рис. 1б). Таким образом, оптимальными условиями приготовления в данном исследовании являются (pH 6,0, Для дальнейшего исследования были приготовлены наночастицы, нагруженные инсулином, с массовым соотношением хитозан/инсулин 2,5:1. При этих условиях приготовления средний размер частиц инсулиновых наночастиц был оптимизирован до 318 нм (рис. 1c), индекс полидисперсности (PDI) составил 0,18, эффективность внедрения — 99,4%, дзета-потенциал — 9,8 мВ, а загрузка инсулина — 25,01% (м/м). На основании результатов просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) оптимизированные наночастицы имели приблизительно сферическую форму и были дискретными, с относительно однородным размером (рис. 1d).
Оптимизация параметров инсулиновых наночастиц: (а) влияние pH на средний диаметр и эффективность инкапсуляции (ЭИ) инсулиновых наночастиц (полученных при массовом соотношении хитозана и инсулина 5:1); (б) влияние массового соотношения хитозана и инсулина на средний диаметр и эффективность инкапсуляции (ЭИ) инсулиновых наночастиц (полученных при pH 6); (в) распределение размеров частиц оптимизированных инсулиновых наночастиц; (г) микрофотография оптимизированных инсулиновых наночастиц, полученная с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ТЭМ).
Хорошо известно, что хитозан является слабым полиэлектролитом с pKa 6,5. Он положительно заряжен в кислой среде, поскольку его основная аминогруппа протонируется ионами водорода15. Поэтому его часто используют в качестве носителя для инкапсуляции отрицательно заряженных макромолекул. В данном исследовании хитозан использовался для инкапсуляции инсулина с изоэлектрической точкой 5,3. Поскольку хитозан используется в качестве покрывающего материала, с увеличением его доли толщина внешнего слоя наночастиц соответственно увеличивается, что приводит к большему среднему размеру частиц. Кроме того, более высокие уровни хитозана позволяют инкапсулировать больше инсулина. В нашем случае эффективность инкапсуляции (EE) была максимальной, когда соотношение хитозана и инсулина достигало 2,5:1, и существенных изменений в EE при дальнейшем увеличении этого соотношения не наблюдалось.
Помимо соотношения хитозана и инсулина, pH также играл решающую роль в приготовлении наночастиц. Ган и др. 17 изучили влияние pH на размер частиц хитозановых наночастиц. Они обнаружили непрерывное уменьшение размера частиц до достижения pH 6,0, а при pH > 6,0 наблюдалось значительное увеличение размера частиц, что согласуется с нашими наблюдениями. Это явление объясняется тем, что с повышением pH молекула инсулина приобретает отрицательный поверхностный заряд, тем самым способствуя электростатическому взаимодействию с комплексом хитозан/триполифосфат натрия (ТФП), что приводит к малому размеру частиц и высокой эффективности инкапсуляции (ЭИ). Однако, когда pH был отрегулирован до 6,5, аминогруппы на хитозане депротонировались, что приводило к сворачиванию хитозана. Таким образом, высокий pH приводит к меньшему воздействию аминоионов на ТФП и инсулин, что приводит к более низкой степени сшивания, большему конечному среднему размеру частиц и более низкой ЭИ.
Анализ морфологических свойств лиофилизированных и распылительно-сушеных наночастиц может помочь в выборе более эффективных методов дегидратации и порошкообразования. Предпочтительный метод должен обеспечивать стабильность лекарственного средства, однородную форму частиц, высокую загрузку лекарственного средства и хорошую растворимость в исходном растворе. В данном исследовании для лучшего сравнения двух методов в процессе дегидратации использовались инсулиновые наночастицы с добавлением или без добавления 1% маннитола. Маннитол используется в качестве наполнителя или криопротектора в различных сухих порошковых составах для лиофилизации и распылительной сушки. Для лиофилизированных инсулиновых наночастиц без маннитола, как показано на рисунке 2а, под сканирующей электронной микроскопией (СЭМ) наблюдалась высокопористая порошковая структура с большими, нерегулярными и шероховатыми поверхностями. После дегидратации в порошке было обнаружено несколько дискретных частиц (рис. 2е). Эти результаты показали, что большинство наночастиц разлагались во время лиофилизации без добавления криопротектора. Для лиофилизированных и распылительно-сушеных инсулиновых наночастиц, содержащих 1% маннитола, сферические наночастицы с Наблюдались гладкие поверхности (рис. 2b,d,f,h). Наночастицы инсулина, высушенные распылением без маннитола, оставались сферическими, но имели морщинистую поверхность (рис. 2c). Сферические и морщинистые поверхности более подробно обсуждаются в тестах на высвобождение и клеточное поглощение ниже. Судя по внешнему виду высушенных наночастиц, как наночастицы, высушенные распылением без маннитола, так и наночастицы, высушенные лиофилизацией и распылением с маннитолом, давали мелкодисперсные порошки наночастиц (рис. 2f,g,h). Чем больше площадь поверхности между частицами, тем выше растворимость и, следовательно, тем выше скорость высвобождения.
Морфология различных дегидратированных наночастиц инсулина: (a) СЭМ-изображение лиофилизированных наночастиц инсулина без маннитола; (b) СЭМ-изображение лиофилизированных наночастиц инсулина с маннитолом; (c) СЭМ-изображение наночастиц инсулина, высушенных распылением без маннитола; (d) СЭМ-изображение наночастиц инсулина, высушенных распылением с маннитолом; (e) изображение порошка лиофилизированных наночастиц инсулина без маннитола; (f) изображение лиофилизированных наночастиц инсулина с маннитолом; (g) изображение порошка наночастиц инсулина, высушенных распылением без маннитола; (h) изображение порошка наночастиц инсулина, высушенных распылением с маннитолом.
В процессе лиофилизации маннит действует как криопротектор, сохраняя наночастицы в аморфной форме и предотвращая повреждение кристаллами льда19. В отличие от этого, при распылительной сушке этап замораживания отсутствует. Поэтому маннит в этом методе не требуется. Фактически, распылительно высушенные наночастицы без маннита давали более мелкие наночастицы, как было описано ранее. Однако маннит все еще может действовать как наполнитель в процессе распылительной сушки, придавая наночастицам более сферическую структуру20 (рис. 2d), что способствует равномерному высвобождению таких инкапсулированных наночастиц. Кроме того, очевидно, что в лиофилизированных и распылительно высушенных инсулиновых наночастицах, содержащих маннит, можно обнаружить некоторые крупные частицы (рис. 2b,d), что может быть связано с накоплением маннита в ядре частицы вместе с инкапсулированным инсулином. К слою хитозана. Стоит отметить, что в данном исследовании, чтобы гарантировать сохранение сферической структуры после дегидратации, соотношение маннита и хитозана поддерживалось на уровне 5:1, так что большое количество наполнителя также может увеличить размер частиц высушенных наночастиц.
Спектроскопия Фурье-преобразования инфракрасного ослабленного полного внутреннего отражения (FTIR-ATR) охарактеризовала физическую смесь свободного инсулина, хитозана, хитозана, ТПП и инсулина. Все дегидратированные наночастицы были охарактеризованы с помощью спектроскопии FTIR-ATR. Примечательно, что интенсивность полос 1641, 1543 и 1412 см⁻¹ наблюдалась в инкапсулированных наночастицах, лиофилизированных с маннитолом, и в наночастицах, распылительно высушенных с маннитолом и без него (рис. 3). Как сообщалось ранее, это увеличение интенсивности было связано с сшиванием между хитозаном, ТПП и инсулином. Исследование взаимодействия между хитозаном и инсулином показало, что в ИК-спектрах наночастиц хитозана, нагруженных инсулином, полоса хитозана перекрывалась с полосой инсулина, увеличивая интенсивность карбонильной группы (1641 см⁻¹) и аминогруппы (1543 см⁻¹). Триполифосфатные группы ТПП связаны с аммониевыми группами в хитозане, образуя полосу на частоте 1412 см⁻¹.
ИК-спектры свободного инсулина, хитозана, физических смесей хитозана/ТПП/инсулина и наночастиц, обезвоженных различными методами.
Кроме того, эти результаты согласуются с данными СЭМ, которые показали, что инкапсулированные наночастицы оставались неповрежденными как при распылении, так и при лиофилизации с маннитолом, но в отсутствие маннитола инкапсулированные частицы образовывались только при распылительной сушке. В отличие от этого, результаты ИК-спектроскопии с нарушенным полным внутренним отражением (FTIR-ATR) наночастиц, лиофилизированных без маннитола, были очень похожи на результаты для физической смеси хитозана, ТПП и инсулина. Этот результат указывает на то, что поперечные связи между хитозаном, ТПП и инсулином больше не присутствуют в наночастицах, лиофилизированных без маннитола. Структура наночастиц разрушалась во время лиофилизации без криопротектора, что видно на результатах СЭМ (рис. 2а). На основании морфологии и результатов FTIR дегидратированных наночастиц инсулина для экспериментов по восстановлению использовались только лиофилизированные, распылительно высушенные и не содержащие маннитола наночастицы, а также наночастицы без маннитола из-за разложения Наночастицы без маннитола в процессе дегидратации. Обсудите.
Обезвоживание используется для длительного хранения и переработки в другие лекарственные формы. Способность сухих наночастиц восстанавливаться после хранения имеет решающее значение для их использования в различных лекарственных формах, таких как таблетки и пленки. Мы заметили, что средний размер частиц распылительно-высушенных инсулиновых наночастиц в отсутствие маннитола увеличился лишь незначительно после восстановления. С другой стороны, размер частиц распылительно-высушенных и лиофилизированных инсулиновых наночастиц с маннитолом значительно увеличился (таблица 1). Индекс полидисперсности (PDI) и эффективность инкапсуляции (EE) существенно не изменились (p > 0,05) после рекомбинации всех наночастиц в этом исследовании (таблица 1). Этот результат указывает на то, что большинство частиц остались неповрежденными после повторного растворения. Однако добавление маннитола привело к значительному снижению содержания инсулина в лиофилизированных и распылительно-высушенных маннитовых наночастицах (таблица 1). В отличие от этого, содержание инсулина в распылительно-высушенных наночастицах без маннитола осталось таким же, как и раньше (таблица 1).
Хорошо известно, что загрузка наночастиц имеет решающее значение при использовании в целях доставки лекарств. Для наночастиц с низкой загрузкой требуются очень большие количества материала для достижения терапевтического порога. Однако высокая вязкость таких высоких концентраций наночастиц приводит к неудобствам и трудностям при пероральном введении и инъекционных формах соответственно 22. Кроме того, инсулиновые наночастицы также могут использоваться для изготовления таблеток и вязких биопленок23, 24, что требует использования больших количеств наночастиц при низких уровнях загрузки, в результате чего получаются большие таблетки и толстые биопленки, непригодные для перорального применения. Поэтому дегидратированные наночастицы с высокой загрузкой инсулина крайне желательны. Наши результаты показывают, что высокая загрузка инсулина в наночастицах, полученных методом распылительной сушки без маннитола, может предложить множество привлекательных преимуществ для этих альтернативных методов доставки.
Все обезвоженные наночастицы хранились в холодильнике в течение трех месяцев. Результаты СЭМ показали, что морфология всех обезвоженных наночастиц существенно не изменилась в течение трехмесячного хранения (рис. 4). После восстановления в воде все наночастицы показали небольшое снижение эффективности инкапсуляции и высвободили приблизительно небольшое количество (~5%) инсулина в течение трехмесячного периода хранения (табл. 2). Однако средний размер частиц всех наночастиц увеличился. Размер частиц наночастиц, высушенных распылением без маннитола, увеличился до 525 нм, в то время как размер частиц наночастиц, высушенных распылением и лиофилизированных с маннитолом, увеличился до 872 и 921 нм соответственно (табл. 2).
Морфология различных обезвоженных наночастиц инсулина, хранившихся в течение трех месяцев: (а) изображение лиофилизированных наночастиц инсулина с маннитолом, полученное с помощью сканирующего электронного микроскопа (СЭМ); (б) изображение высушенных распылением наночастиц инсулина без маннитола, полученное с помощью СЭМ; (в) изображения высушенных распылением наночастиц инсулина без маннитола, полученные с помощью СЭМ.
Кроме того, в реконструированных наночастицах инсулина, подвергнутых распылительной сушке с маннитолом и лиофилизации, наблюдались осадки (рис. S2). Это может быть вызвано тем, что крупные частицы ненадлежащим образом суспендируются в воде. Все вышеперечисленные результаты показывают, что метод распылительной сушки может защитить наночастицы инсулина от обезвоживания и что можно получить высокую концентрацию наночастиц инсулина без каких-либо наполнителей или криопротекторов.
Для демонстрации защитной способности наночастиц от ферментативного расщепления после дегидратации была проведена проверка удержания инсулина в среде с pH = 2,5 с использованием пепсина, трипсина и α-химотрипсина. Удержание инсулина дегидратированными наночастицами сравнивали с удержанием инсулина свежеприготовленными наночастицами, а свободный инсулин использовали в качестве отрицательного контроля. В этом исследовании свободный инсулин показал быстрое выведение инсулина в течение 4 часов при всех трех ферментативных обработках (рис. 5a–c). В отличие от этого, тестирование выведения инсулина наночастицами, лиофилизированными с маннитолом, и наночастицами, распыленно-высушенными с маннитолом или без него, показало значительно более высокую защиту этих наночастиц от ферментативного расщепления, аналогичную защите свежеприготовленных инсулиновых наночастиц (рис. 1). 5a–c). С помощью наночастиц, обработанных пепсином, трипсином и α-химотрипсином, более 50%, 60% и 75% инсулина удалось защитить в течение 4 часов. соответственно (рис. 5a–c). Эта способность защищать от инсулина может повысить вероятность более высокого всасывания инсулина в кровоток25. Эти результаты показывают, что распылительная сушка с маннитолом или без него, а также лиофилизация с маннитолом могут сохранить способность наночастиц защищать от инсулина после дегидратации.
Защитное и высвобождение дегидратированных наночастиц инсулина: (a) защита инсулина в растворе пепсина; (b) защита инсулина в растворе трипсина; (c) защита инсулина в растворе α-химотрипсина; (d) высвобождение дегидратированных наночастиц в растворе с pH = 2,5; (e) высвобождение дегидратированных наночастиц в растворе с pH = 6,6; (f) высвобождение дегидратированных наночастиц в растворе с pH = 7,0.
Свежеприготовленные и восстановленные сухие инсулиновые наночастицы инкубировали в различных буферных растворах (pH = 2,5, 6,6, 7,0) при 37 °C, имитирующих pH-среду желудка, двенадцатиперстной кишки и верхнего отдела тонкой кишки, для изучения влияния инсулина на инсулинорезистентность. Поведение при высвобождении в различных средах. Фрагмент желудочно-кишечного тракта. При pH = 2,5 наночастицы, нагруженные инсулином, и рерастворенные сухие наночастицы инсулина показали первоначальное быстрое высвобождение в течение первого часа, за которым последовало медленное высвобождение в течение следующих 5 часов (рис. 5d). Это быстрое высвобождение в начале, скорее всего, является результатом быстрой поверхностной десорбции молекул белка, которые не полностью иммобилизованы во внутренней структуре частицы. При pH = 6,5 наночастицы, нагруженные инсулином, и реконструированные сухие наночастицы инсулина показали плавное и медленное высвобождение в течение 6 часов, поскольку pH тестового раствора был аналогичен pH раствора, в котором были приготовлены наночастицы (рис. 5e). При pH = 7 наночастицы были нестабильны и почти полностью разложились в течение первых двух часов (рис. 5f). Это связано с тем, что депротонирование хитозана происходит при более высоком pH, что приводит к менее компактной полимерной сетке и высвобождению нагруженного инсулина.
Кроме того, наночастицы инсулина, высушенные распылением без маннитола, показали более быстрый профиль высвобождения, чем другие обезвоженные наночастицы (рис. 5d–f). Как было описано ранее, реконструированные наночастицы инсулина, высушенные без маннитола, имели наименьший размер частиц. Маленькие частицы обеспечивают большую площадь поверхности, поэтому большая часть соответствующего лекарственного средства будет находиться на поверхности частицы или вблизи нее, что приводит к быстрому высвобождению лекарственного средства26.
Цитотоксичность наночастиц исследовали с помощью анализа MTT. Как показано на рисунке S4, все дегидратированные наночастицы не оказывали существенного влияния на жизнеспособность клеток при концентрациях 50–500 мкг/мл, что позволяет предположить, что все дегидратированные наночастицы могут безопасно использоваться для достижения терапевтического диапазона.
Печень является основным органом, через который инсулин осуществляет свои физиологические функции. Клетки HepG2 — это линия клеток гепатомы человека, обычно используемая в качестве модели поглощения гепатоцитами in vitro. В данном исследовании клетки HepG2 использовались для оценки клеточного поглощения наночастиц, обезвоженных методами лиофилизации и распылительной сушки. Клеточный поглощение оценивали с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии с использованием проточной цитометрии и визуализации после нескольких часов инкубации со свободным инсулином FITC в концентрации 25 мкг/мл, свежеприготовленными наночастицами, нагруженными инсулином FITC, и обезвоженными наночастицами, нагруженными инсулином FITC, при равных концентрациях инсулина. Были проведены количественные микроскопические наблюдения (CLSM). Лиофилизированные наночастицы без маннитола разрушались в процессе обезвоживания и не оценивались в этом тесте. Интенсивность внутриклеточной флуоресценции свежеприготовленных наночастиц, нагруженных инсулином, лиофилизированных наночастиц с маннитолом и наночастиц, высушенных распылением, с маннитолом и без него. Содержание маннитола (рис. 6а) было в 4,3, 2,6, 2,4 и 4,1 раза выше, чем в группе с FITC-инсулином (рис. 6б). Эти результаты свидетельствуют о том, что инкапсулированный инсулин обладает большей эффективностью в клеточном поглощении, чем свободный инсулин, главным образом из-за меньшего размера наночастиц, содержащих инсулин, полученных в исследовании.
Поглощение клетками HepG2 после 4-часовой инкубации со свежеприготовленными и обезвоженными наночастицами: (a) Распределение поглощения FITC-инсулина клетками HepG2. (b) Геометрическое среднее интенсивностей флуоресценции, проанализированных методом проточной цитометрии (n = 3), *P < 0,05 по сравнению со свободным инсулином.
Аналогично, изображения, полученные с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (КЛСМ), показали, что интенсивность флуоресценции FITC в свежеприготовленных наночастицах, нагруженных FITC-инсулином, и в наночастицах, полученных методом распылительной сушки и нагруженных FITC-инсулином (без маннитола), была значительно выше, чем в других образцах (рис. 6а). Кроме того, добавление маннитола приводило к увеличению вязкости раствора и повышению сопротивления клеточному поглощению, что, в свою очередь, снижало пролиферацию инсулина. Эти результаты свидетельствуют о том, что наночастицы, полученные методом распылительной сушки без маннитола, демонстрировали самую высокую эффективность клеточного поглощения, поскольку их размер частиц был меньше, чем у лиофилизированных наночастиц после повторного растворения.
Хитин (средняя молекулярная масса 100 кДа, 75–85% деацетилированный) был приобретен у компании Sigma-Aldrich (Оквилл, Онтарио, Канада). Триполифосфат натрия (ТПФ) был приобретен у компании VWR (Раднор, Пенсильвания, США). Рекомбинантный человеческий инсулин, использованный в этом исследовании, был приобретен у компании Fisher Scientific (Уолтем, Массачусетс, США). Меченый флуоресцеин изотиоцианатом (FITC) человеческий инсулин и дигидрохлорид 4′,6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) были приобретены у компании Sigma-Aldrich (Оквилл, Онтарио, Канада). Клеточная линия HepG2 была получена из ATCC (Манассас, Вирджиния, США). Все остальные реактивы имели аналитическую или хроматографическую чистоту.
Приготовьте раствор CS с концентрацией 1 мг/мл, растворив его в дважды дистиллированной воде (ДД), содержащей 0,1% уксусной кислоты. Приготовьте растворы TPP и инсулина с концентрацией 1 мг/мл, растворив их в ДД и 0,1% уксусной кислоте соответственно. Предварительная эмульсия была приготовлена ​​с помощью высокоскоростного гомогенизатора Polytron PCU-2-110 (Brinkmann Ind., Вестбери, Нью-Йорк, США). Процесс приготовления следующий: сначала 2 мл раствора TPP добавляют к 4 мл раствора инсулина, смесь перемешивают в течение 30 минут до полного смешивания. Затем полученный раствор добавляют по каплям к раствору CS с помощью шприца при высокоскоростном перемешивании (10 000 об/мин). Смеси выдерживают при высокоскоростном перемешивании (15 000 об/мин) в ледяной бане в течение 30 минут, после чего доводят до определенного значения pH для получения сшитых наночастиц инсулина. Для дальнейшей гомогенизации и уменьшения размера частиц инсулина Наночастицы дополнительно подвергали ультразвуковой обработке в течение 30 минут в ледяной ванне с использованием ультразвукового зондового аппарата (UP 200ST, Hielscher Ultrasonics, Тельтов, Германия).
Наночастицы инсулина были исследованы на предмет среднего диаметра (Z-средний диаметр), индекса полидисперсности (PDI) и дзета-потенциала с помощью динамического рассеяния света (DLS) на приборе Litesizer 500 (Anton Paar, Грац, Австрия) путем разведения их в дистиллированной воде при 25°C. Морфология и распределение по размерам были охарактеризованы с помощью просвечивающего электронного микроскопа Hitachi H7600 (TEM) (Hitachi, Токио, Япония), а изображения впоследствии анализировались с помощью программного обеспечения Hitachi для обработки изображений (Hitachi, Токио, Япония). Для оценки эффективности инкапсуляции (EE) и загрузочной способности (LC) наночастиц инсулина, наночастицы были помещены в ультрафильтрационные трубки с порогом молекулярной массы 100 кДа и центрифугированы при 500 xg в течение 30 мин. Неинкапсулированный инсулин в фильтрате был количественно определен с помощью системы ВЭЖХ Agilent 1100 Series (Agilent, Санта-Клара, Калифорния, США), состоящей из Кватернарный насос, автосамплер, нагреватель колонки и детектор DAD. Инсулин анализировали на колонке C18 (Zorbax, 3,5 мкм, 4,6 мм × 150 мм, Agilent, США) и детектировали при 214 нм. Подвижная фаза состояла из ацетонитрила и воды, содержащей 0,1% ТФК, с градиентным соотношением от 10/90 до 100/0, и работала в течение 10 минут. Подвижная фаза подавалась со скоростью потока 1,0 мл/мин. Температура колонки была установлена ​​на 20 °C. Рассчитайте проценты EE и LC, используя уравнения (1) и (2).
Для оптимизации образования инсулиновых наночастиц были протестированы различные соотношения CS/инсулин в диапазоне от 2,0 до 4,0. В процессе приготовления добавляли различное количество раствора CS, при этом соотношение смеси инсулина и TPP оставалось постоянным. Инсулиновые наночастицы готовили в диапазоне pH от 4,0 до 6,5, тщательно контролируя pH смеси после добавления всех растворов (инсулина, TPP и CS). Эффективность инкапсуляции (EE) и размер частиц инсулиновых наночастиц оценивали при различных значениях pH и массовых соотношениях CS/инсулин для оптимизации образования инсулиновых наночастиц.
Оптимизированные наночастицы инсулина были помещены в алюминиевый контейнер и покрыты тканью, закрепленной скотчем. Затем завинчивающиеся контейнеры были помещены в сушилку для замораживания Labconco FreeZone (Labconco, Канзас-Сити, Миссури, США), оснащенную лотковой сушилкой. Температура и вакуумное давление были установлены на уровне -10 °C и 0,350 Торр в течение первых 2 часов, а затем на уровне 0 °C и 0,120 Торр в течение оставшихся 22 часов из 24 часов для получения сухих наночастиц инсулина.
Для получения инкапсулированного инсулина использовалась мини-распылительная сушилка Buchi B-290 (BÜCHI, Флавиль, Швейцария). Выбранные параметры сушки: температура 100 °C, поток подачи 3 л/мин и поток газа 4 л/мин.
Наночастицы инсулина до и после дегидратации были охарактеризованы с помощью ИК-спектроскопии с нарушенным полным внутренним отражением (FTIR-ATR). Дегидратированные наночастицы, а также свободный инсулин и хитозан анализировались с помощью ИК-спектрофотометра Spectrum 100 (PerkinElmer, Уолтем, Массачусетс, США), оснащенного универсальным устройством для отбора проб ATR (PerkinElmer, Уолтем, Массачусетс, США). Усредненные сигналы были получены из 16 сканирований с разрешением 4 см² в диапазоне частот 4000-600 см².
Морфология сухих наночастиц инсулина оценивалась с помощью изображений лиофилизированных и распылительно-высушенных наночастиц инсулина, полученных с помощью сканирующего электронного микроскопа с фокусированным ионным пучком Helios NanoLab 650 (FIB-SEM) (FEI, Хиллсборо, Орегон, США). Основными используемыми параметрами были напряжение 5 кэВ и ток 30 мА.
Все обезвоженные наночастицы инсулина были повторно растворены в дистиллированной воде. Размер частиц, индекс полидисперсности (PDI), эффективность инкапсуляции (EE) и содержание летучих веществ (LC) были повторно протестированы с использованием того же метода, что и ранее, для оценки их качества после обезвоживания. Стабильность наночастиц ангидроинсулина также была измерена путем тестирования свойств наночастиц после длительного хранения. В этом исследовании все наночастицы после обезвоживания хранились в холодильнике в течение трех месяцев. После трех месяцев хранения наночастицы были протестированы на морфологический размер частиц, PDI, EE и LC.
Для оценки эффективности инсулина в защите наночастиц после дегидратации растворяли 5 мл восстановленных наночастиц в 45 мл раствора, содержащего имитированную желудочную жидкость (pH 1,2, содержащую 1% пепсина), кишечную жидкость (pH 6,8, содержащую 1% трипсина) или раствор химотрипсина (100 мкг/мл, в фосфатном буфере, pH 7,8). Растворы инкубировали при 37°C со скоростью перемешивания 100 об/мин. Через разные промежутки времени отбирали по 500 мкл раствора, и концентрацию инсулина определяли методом ВЭЖХ.
Высвобождение инсулина из свежеприготовленных и обезвоженных наночастиц in vitro исследовали методом диализного мешка (с порогом молекулярной массы 100 кДа, Spectra Por Inc.). Свежеприготовленные и восстановленные сухие наночастицы диализировали в жидкостях с pH 2,5, pH 6,6 и pH 7,0 (0,1 М фосфатно-буферный солевой раствор, PBS) для имитации pH-среды желудка, двенадцатиперстной кишки и верхнего отдела тонкой кишки соответственно. Все образцы инкубировали при 37 °C с непрерывным перемешиванием со скоростью 200 об/мин. Жидкость отсасывали из 5-миллилитрового диализного мешка в следующие моменты времени: 0,5, 1, 2, 3, 4 и 6 ч, и немедленно пополняли объем свежим диализатом. Загрязнение жидкости инсулином анализировали методом ВЭЖХ, а скорость высвобождения инсулина из наночастиц рассчитывали как отношение высвобожденного свободного инсулина к общему количеству инкапсулированного инсулина. в наночастицах (Уравнение 3).
Клетки линии HepG2 (гепатоцеллюлярная карцинома человека) выращивали в чашках диаметром 60 мм с использованием модифицированной среды Игла Дульбекко (DMEM), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, 100 МЕ/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина29. Культуры поддерживали при температуре 37°C, относительной влажности 95% и CO2 5%. Для анализа поглощения клетки HepG2 высевали в количестве 1 × 10⁵ клеток/мл на 8-луночную систему предметных стекол Nunc Lab-Tek (Thermo Fisher, Нью-Йорк, США). Для анализа цитотоксичности их высевали в 96-луночные планшеты (Corning, Нью-Йорк, США) с плотностью 5 × 10⁴ клеток/мл.
Для оценки цитотоксичности свежеприготовленных и дегидратированных инсулиновых наночастиц30 использовали МТТ-анализ. Клетки HepG2 высевали в 96-луночные планшеты с плотностью 5 × 10⁴ клеток/мл и культивировали в течение 7 дней до проведения тестирования. Инсулиновые наночастицы разбавляли до различных концентраций (от 50 до 500 мкг/мл) в культуральной среде, а затем вводили в клетки. После 24 часов инкубации клетки трижды промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) и инкубировали в среде, содержащей 0,5 мг/мл МТТ, еще 4 часа. Цитотоксичность оценивали путем измерения ферментативного восстановления желтого тетразолия МТТ до пурпурного формазана при 570 нм с использованием спектрофотометра Tecan infinite M200 pro (Tecan, Мённедорф, Швейцария).
Эффективность клеточного поглощения наночастиц была протестирована с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии и проточной цитометрии. Каждая лунка системы предметных стекол Nunc Lab-Tek обрабатывалась свободным FITC-инсулином, наночастицами, нагруженными FITC-инсулином, и реконструированными 25 мкг/мл дегидратированными наночастицами FITC-инсулина в той же концентрации, после чего инкубировалась в течение 4 часов. Клетки промывали 3 раза фосфатно-солевым буфером (PBS) и фиксировали 4% параформальдегидом. Ядра окрашивали 4′,6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI). Локализацию инсулина наблюдали с помощью лазерного сканирующего/двухфотонного конфокального микроскопа Olympus FV1000 (Olympus, Синдзюку, Токио, Япония). Для анализа методом проточной цитометрии использовались те же концентрации 10 мкг/мл свободного FITC-инсулина и наночастиц, нагруженных FITC-инсулином. Наночастицы (НП) и рерастворенные обезвоженные FITC-инсулиновые НП были добавлены в 96-луночные планшеты, засеянные клетками HepG2, и инкубированы в течение 4 часов. После 4 часов инкубации клетки были удалены и промыты 3 раза фетальной бычьей сывороткой (FBS). 5 × 10⁴ клеток на образец анализировались с помощью проточного цитометра BD LSR II (BD, Франклин-Лейкс, Нью-Джерси, США).
Все значения представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. Сравнения между всеми группами проводились с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) или t-критерия в программе IBM SPSS Statistics 26 для Mac (IBM, Эндикотт, Нью-Йорк, США), и p < 0,05 считалось статистически значимым.
Данное исследование демонстрирует гибкость и способность метода распылительной сушки обезвоживать сшитые наночастицы хитозана/ТПП/инсулина с лучшим восстановлением по сравнению со стандартными методами лиофилизации с использованием наполнителей или криопротекторов, а также более высокой загрузочной способностью. Оптимизированные наночастицы инсулина имели средний размер частиц 318 нм и эффективность инкапсуляции 99,4%. Результаты СЭМ и ИК-спектроскопии после обезвоживания показали, что сферическая структура сохранялась только в распылительно-высушенных наночастицах с маннитолом и без него, а также в лиофилизированных с маннитолом наночастицах, тогда как лиофилизированные наночастицы без маннитола разлагались в процессе обезвоживания. В тесте на способность к восстановлению наночастицы инсулина, распылительно-высушенные без маннитола, показали наименьший средний размер частиц и наибольшую загрузку при восстановлении. Характеристики высвобождения всех этих обезвоженных наночастиц показали, что они быстро высвобождались в растворах с pH = 2,5 и pH = 7 и были очень стабильны в растворе с pH = 6.5. По сравнению с другими повторно растворенными обезвоженными наночастицами, наночастицы, высушенные распылением без маннитола, показали самое быстрое высвобождение. Этот результат согласуется с результатами, полученными в ходе анализа клеточного поглощения, поскольку наночастицы, высушенные распылением в отсутствие маннитола, практически полностью сохранили эффективность клеточного поглощения свежеприготовленных наночастиц. Эти результаты свидетельствуют о том, что сухие наночастицы инсулина, полученные методом распылительной сушки без маннитола, наиболее подходят для дальнейшей переработки в другие безводные лекарственные формы, такие как таблетки для приема внутрь или биоадгезивные пленки.
В связи с вопросами интеллектуальной собственности, наборы данных, сгенерированные и/или проанализированные в ходе данного исследования, не являются общедоступными, но могут быть предоставлены соответствующими авторами по обоснованному запросу.
Каган, А. Диабет 2 типа: социальные и научные истоки, медицинские осложнения и последствия для пациентов и окружающих. (Макфарлейн, 2009).
Сингх, А.П., Го, Ю., Сингх, А., Се, В. и Цзян, П. Разработка инкапсуляции инсулина: возможно ли теперь пероральное применение? Журнал фармации. биофармации. резервуар.1, 74–92 (2019).
Вонг, CY, Аль-Салами, H. и Дасс, CR. Последние достижения в области систем доставки инсулина в виде липосом для лечения диабета. Интерпретация. Журнал фармации. 549, 201–217 (2018).