Данная статья является частью исследовательской темы «Повышение устойчивости бобовых к патогенам и вредителям», посмотреть все 5 статей.
Возбудитель грибкового заболевания растений — некроза, Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary — использует многоуровневую стратегию для заражения различных растений-хозяев. В данном исследовании предлагается использовать диамин L-орнитин, непротеиновую аминокислоту, стимулирующую синтез других незаменимых аминокислот, в качестве альтернативной стратегии борьбы для усиления молекулярных, физиологических и биохимических реакций Phaseolus vulgaris L. на белую гниль, вызываемую Pseudomonas sclerotiorum. Эксперименты in vitro показали, что L-орнитин значительно ингибирует рост мицелия S. pyrenoidosa в зависимости от дозы. Более того, он может значительно снизить тяжесть белой гнили в условиях теплицы. Кроме того, L-орнитин стимулирует рост обработанных растений, что указывает на то, что исследованные концентрации L-орнитина не являются фитотоксичными для обработанных растений. Кроме того, L-орнитин усиливал экспрессию неферментативных антиоксидантов (общее количество растворимых фенолов и флавоноидов) и ферментативных антиоксидантов (каталазы (CAT), пероксидазы (POX) и полифенолоксидазы (PPO)), а также увеличивал экспрессию трех генов, связанных с антиоксидантами (PvCAT1, PvSOD и PvGR). Более того, анализ in silico выявил наличие предполагаемого белка оксалоацетат-ацетилгидролазы (SsOAH) в геноме S. sclerotiorum, который был очень похож на белки оксалоацетат-ацетилгидролазы (SsOAH) Aspergillus fijiensis (AfOAH) и Penicillium sp. (PlOAH) с точки зрения функционального анализа, консервативных доменов и топологии. Интересно, что добавление L-орнитина в среду картофельно-декстрозного бульона (PDB) значительно снизило экспрессию гена SsOAH в мицелии S. sclerotiorum. Аналогично, экзогенное применение L-орнитина значительно снизило экспрессию гена SsOAH в мицелии гриба, собранном с обработанных растений. Наконец, применение L-орнитина значительно снизило секрецию щавелевой кислоты как в среде PDB, так и в зараженных листьях. В заключение, L-орнитин играет ключевую роль в поддержании окислительно-восстановительного статуса, а также в усилении защитной реакции зараженных растений. Результаты этого исследования могут помочь в разработке инновационных, экологически чистых методов борьбы с белой плесенью и смягчении ее воздействия на производство бобовых и других культур.
Белая плесень, вызываемая некротрофным грибом Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, является разрушительным заболеванием, снижающим урожайность и представляющим серьезную угрозу для мирового производства фасоли (Phaseolus vulgaris L.) (Bolton et al., 2006). Sclerotinia sclerotiorum — один из наиболее трудно поддающихся контролю почвенных грибковых патогенов растений, имеющий широкий круг хозяев, насчитывающий более 600 видов растений, и способный быстро и неспецифически разъедать ткани хозяина (Liang and Rollins, 2018). В неблагоприятных условиях он проходит критическую фазу своего жизненного цикла, оставаясь в состоянии покоя в течение длительного времени в виде черных, твердых, похожих на семена структур, называемых «склероциями», в почве или в виде белых, пушистых наростов в мицелии или сердцевине стебля зараженных растений (Schwartz et al., 2005). S. sclerotiorum способен образовывать склероции, что позволяет ему выживать на зараженных полях в течение длительного времени и сохраняться во время болезни (Schwartz et al., 2005). Склероции богаты питательными веществами, могут долго сохраняться в почве и служить первичным инокулятом для последующих инфекций (Schwartz et al., 2005). В благоприятных условиях склероции прорастают и производят переносимые по воздуху споры, которые могут поражать все надземные части растения, включая, помимо прочего, цветки, стебли и стручки (Schwartz et al., 2005).
Гриб Sclerotinia sclerotiorum использует многоуровневую стратегию заражения растений-хозяев, включающую ряд скоординированных событий от прорастания склероциев до развития симптомов. Первоначально S. sclerotiorum производит взвешенные споры (называемые аскоспорами) из грибовидных структур, называемых апотециями, которые попадают в воздух и развиваются в неподвижные склероции на зараженных растительных остатках (Bolton et al., 2006). Затем гриб выделяет щавелевую кислоту, фактор вирулентности, для контроля pH клеточной стенки растения, стимулирования ферментативной деградации и инвазии в ткани (Hegedus and Rimmer, 2005), а также подавления окислительного взрыва растения-хозяина. Этот процесс закисления ослабляет клеточную стенку растения, создавая благоприятную среду для нормальной и эффективной работы грибковых ферментов, разрушающих клеточную стенку (CWDE), что позволяет патогену преодолеть физический барьер и проникнуть в ткани хозяина (Marciano et al., 1983). После проникновения в клетку S. sclerotiorum выделяет ряд веществ, способствующих распространению грибка в инфицированных тканях, таких как полигалактуроназа и целлюлаза, которые вызывают некроз тканей. Развитие поражений и гифальных скоплений приводит к характерным симптомам белой плесени (Hegedus and Rimmer, 2005). Тем временем растения-хозяева распознают патоген-ассоциированные молекулярные паттерны (PAMP) через рецепторы распознавания паттернов (PRR), запуская серию сигнальных событий, которые в конечном итоге активируют защитные реакции.
Несмотря на десятилетия усилий по борьбе с болезнями, в бобовых, как и в других товарных культурах, сохраняется дефицит адекватного устойчивого генофонда из-за устойчивости, выживаемости и адаптивности патогена. Поэтому борьба с болезнями представляет собой чрезвычайно сложную задачу и требует комплексной, многогранной стратегии, включающей сочетание агротехнических приемов, биологического контроля и химических фунгицидов (O'Sullivan et al., 2021). Химический контроль белой гнили является наиболее эффективным, поскольку фунгициды, при правильном и своевременном применении, могут эффективно контролировать распространение болезни, снижать тяжесть инфекции и минимизировать потери урожая. Однако чрезмерное использование и чрезмерная зависимость от фунгицидов могут привести к появлению устойчивых штаммов S. sclerotiorum и негативно повлиять на нецелевые организмы, здоровье почвы и качество воды (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). Поэтому поиск экологически чистых альтернатив стал первоочередной задачей.
Полиамины (ПА), такие как путресцин, спермидин, спермин и кадаверин, могут служить перспективной альтернативой против почвенных патогенов растений, тем самым полностью или частично сокращая использование опасных химических фунгицидов (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). У высших растений ПА участвуют во многих физиологических процессах, включая, помимо прочего, деление клеток, дифференциацию и реакцию на абиотические и биотические стрессы (Killiny and Nehela, 2020). Они могут действовать как антиоксиданты, помогать нейтрализовать активные формы кислорода (АФК), поддерживать окислительно-восстановительный гомеостаз (Nehela and Killiny, 2023), индуцировать гены, связанные с защитой (Romero et al., 2018), регулировать различные метаболические пути (Nehela and Killiny, 2023), модулировать эндогенные фитогормоны (Nehela and Killiny, 2019), устанавливать системную приобретенную устойчивость (САР) и регулировать взаимодействие растений с патогенами (Nehela and Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). Стоит отметить, что специфические механизмы и роли полиаминов в защите растений различаются в зависимости от вида растения, патогена и условий окружающей среды. Наиболее распространенный полиамин в растениях биосинтезируется из незаменимого полиамина L-орнитина (Killiny and Nehela, 2020).
L-орнитин играет множество ролей в росте и развитии растений. Например, предыдущие исследования показали, что у риса (Oryza sativa) орнитин может быть связан с рециркуляцией азота (Liu et al., 2018), урожайностью, качеством и ароматом риса (Lu et al., 2020), а также реакцией на водный стресс (Yang et al., 2000). Кроме того, экзогенное применение L-орнитина значительно повысило засухоустойчивость сахарной свеклы (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019) и снизило солевой стресс у лука (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu and Çavuşoǧlu, 2021) и кешью (Anacardium occidentale) (da Rocha et al., 2012). Потенциальная роль L-орнитина в защите от абиотического стресса может быть обусловлена ​​его участием в накоплении пролина в обработанных растениях. Например, ранее сообщалось, что гены, связанные с метаболизмом пролина, такие как гены орнитин-дельта-аминотрансферазы (дельта-OAT) и пролиндегидрогеназы (ProDH1 и ProDH2), участвуют в защите Nicotiana benthamiana и Arabidopsis thaliana от неспецифических штаммов Pseudomonas syringae (Senthil-Kumar и Mysore, 2012). С другой стороны, грибковая орнитиндекарбоксилаза (ODC) необходима для роста патогена (Singh et al., 2020). Воздействие на ODC Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici посредством подавления генов, индуцированного хозяином (HIGS), значительно повысило устойчивость томатов к фузариозному увяданию (Singh et al., 2020). Однако потенциальная роль экзогенного применения орнитина против биотических стрессов, таких как фитопатогены, изучена недостаточно. Что еще более важно, влияние орнитина на устойчивость к болезням и связанные с этим биохимические и физиологические явления остаются в значительной степени неизученными.
Понимание сложности инфекции S. sclerotiorum бобовых культур важно для разработки эффективных стратегий борьбы. В данном исследовании мы стремились определить потенциальную роль диамина L-орнитина как ключевого фактора в усилении защитных механизмов и устойчивости бобовых растений к инфекции Sclerotinia sclerotiorum. Мы предполагаем, что, помимо усиления защитных реакций зараженных растений, L-орнитин также играет ключевую роль в поддержании окислительно-восстановительного статуса. Мы предполагаем, что потенциальные эффекты L-орнитина связаны с регуляцией ферментативных и неферментативных антиоксидантных защитных механизмов и вмешательством в факторы патогенности/вирулентности грибка и связанные с ними белки. Эта двойная функциональность L-орнитина делает его перспективным кандидатом для устойчивой стратегии смягчения воздействия белой гнили и повышения устойчивости распространенных бобовых культур к этому мощному грибковому патогену. Результаты настоящего исследования могут помочь в разработке инновационных, экологически чистых методов борьбы с белой гнилью и смягчения ее воздействия на производство бобовых.
В данном исследовании в качестве экспериментального материала использовался восприимчивый коммерческий сорт фасоли обыкновенной, Гиза 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3). Здоровые семена были любезно предоставлены отделом исследований бобовых культур Института полевых исследований сельскохозяйственных культур (FCRI), Сельскохозяйственного исследовательского центра (ARC), Египет. Пять семян были посеяны в пластиковые горшки (внутренний диаметр 35 см, глубина 50 см), заполненные почвой, зараженной S. sclerotiorum, в условиях теплицы (25 ± 2 °C, относительная влажность 75 ± 1%, 8 ч света/16 ч темноты). Через 7–10 дней после посева (DPS) в каждом горшке были прорежены всходы, оставив только два всхода с равномерным ростом и тремя полностью распустившимися листьями. Все растения в горшках поливали раз в две недели и удобряли ежемесячно в рекомендуемой для данного сорта дозировке.
Для приготовления раствора L-орнитиндиамина (также известного как (+)-(S)-2,5-диаминопентановая кислота; Sigma-Aldrich, Дармштадт, Германия) с концентрацией 500 мг/л, 50 мг сначала растворяли в 100 мл стерильной дистиллированной воды. Затем исходный раствор разбавляли и использовали в последующих экспериментах. Вкратце, in vitro были протестированы шесть серий концентраций L-орнитина (12,5, 25, 50, 75, 100 и 125 мг/л). Кроме того, в качестве отрицательного контроля (Mock) использовалась стерильная дистиллированная вода, а в качестве положительного контроля — коммерческий фунгицид «Ризолекс-Т» в виде 50% смачиваемого порошка (токлофос-метил 20% + тирам 30%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Кафр-эль-Заят, провинция Гарбия, Египет). Коммерческий фунгицид «Ризолекс-Т» был протестирован in vitro при пяти концентрациях (2, 4, 6, 8 и 10 мг/л).
Образцы стеблей и стручков фасоли обыкновенной, демонстрирующие типичные симптомы белой плесени (степень поражения: 10–30%), были собраны на коммерческих фермах. Хотя большинство зараженных растительных материалов были идентифицированы по виду/сорту (восприимчивый коммерческий сорт Giza 3), другие, особенно полученные на местных рынках, имели неизвестный вид. Собранные зараженные материалы сначала дезинфицировали поверхностно 0,5% раствором гипохлорита натрия в течение 3 минут, затем несколько раз промывали стерильной дистиллированной водой и вытирали насухо стерильной фильтровальной бумагой для удаления избытка воды. Затем зараженные органы разрезали на небольшие кусочки из средней ткани (между здоровой и зараженной тканями), культивировали на картофельно-декстрозном агаре (PDA) и инкубировали при 25 ± 2 °C с 12-часовым световым/12-часовым темным циклом в течение 5 дней для стимуляции образования склероций. Метод кончика мицелия также использовался для очистки грибковых изолятов из смешанных или зараженных культур. Очищенный изолят гриба был сначала идентифицирован на основе его культуральных морфологических характеристик, а затем подтвержден как S. sclerotiorum на основе микроскопических признаков. Наконец, все очищенные изоляты были протестированы на патогенность на восприимчивом сорте фасоли обыкновенной Giza 3 для выполнения постулатов Коха.
Кроме того, наиболее инвазивный изолят S. sclerotiorum (изолят № 3) был дополнительно подтвержден на основе секвенирования внутреннего транскрибируемого спейсера (ITS), как описано Уайтом и др., 1990; Батуро-Циесневской и др., 2017. Вкратце, изоляты культивировали в картофельно-декстрозном бульоне (PDB) и инкубировали при 25 ± 2 °C в течение 5–7 дней. Затем мицелий гриба собирали, фильтровали через марлю, дважды промывали стерильной водой и высушивали стерильной фильтровальной бумагой. Геномную ДНК выделяли с использованием набора Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep Kit (Курамаэ-Изиока, 1997; Аталла и др., 2022, 2024). Затем область ITS рДНК была амплифицирована с использованием специфической пары праймеров ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; ожидаемый размер: 540 п.н.) (Baturo-Ciesniewska et al., 2017). Очищенные ПЦР-продукты были отправлены на секвенирование (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). Последовательности ITS рДНК были секвенированы в обоих направлениях с использованием метода секвенирования по Сэнгеру. Собранные последовательности затем сравнивались с последними данными в GenBank и Национальном центре биотехнологической информации (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) с помощью программного обеспечения BLASTn. Последовательность запроса сравнивалась с 20 другими штаммами/изолятами S. sclerotiorum, полученными из последних данных в NCBI GenBank (дополнительная таблица S1), с использованием ClustalW из пакета анализа молекулярной эволюционной генетики (MEGA-11; версия 11) (Kumar et al., 2024). Эволюционный анализ проводился с использованием метода максимального правдоподобия и общей модели обратимой во времени замены нуклеотидов (Nei и Kumar, 2000). Показано дерево с наивысшим логарифмическим правдоподобием. Начальное дерево для эвристического поиска выбирается путем выбора дерева с более высоким логарифмическим правдоподобием между деревом, построенным методом ближайшего соседа (NJ) (Kumar et al., 2024), и деревом, построенным методом максимальной экономии (MP). Дерево NJ было построено с использованием матрицы попарных расстояний, рассчитанной с помощью общей модели обратимой во времени замены (Nei и Kumar, 2000).
Антибактериальная активность L-орнитина и бактерицида «Ризолекс-Т» определялась in vitro методом диффузии в агаре. Методика: брали соответствующее количество исходного раствора L-орнитина (500 мг/л) и тщательно смешивали его с 10 мл питательной среды PDA для приготовления растворов с конечными концентрациями 12,5, 25, 50, 75, 100 и 125 мг/л соответственно. В качестве контроля использовали пять концентраций фунгицида «Ризолекс-Т» (2, 4, 6, 8 и 10 мг/л) и стерильную дистиллированную воду. После застывания среды свежеприготовленный мицелиальный диск культуры Sclerotinia sclerotiorum диаметром 4 мм переносили в центр чашки Петри и культивировали при температуре 25±2°C до тех пор, пока мицелий не покрывал всю контрольную чашку Петри, после чего регистрировали рост грибка. Рассчитайте процент ингибирования радиального роста S. sclerotiorum, используя уравнение 1:
Эксперимент был повторен дважды, с шестью биологическими повторами для каждой контрольной/экспериментальной группы и пятью горшками (по два растения в горшке) для каждого биологического повтора. Каждый биологический повтор анализировался дважды (два технических повтора) для обеспечения точности, надежности и воспроизводимости результатов эксперимента. Кроме того, для расчета полумаксимальной ингибирующей концентрации (IC50) и IC99 использовался пробит-регрессионный анализ (Prentice, 1976).
Для оценки потенциала L-орнитина в тепличных условиях были проведены два последовательных эксперимента в горшках. Вкратце, горшки заполняли стерилизованной глинисто-песчаной почвой (3:1) и инокулировали свежеприготовленной культурой S. sclerotiorum. Сначала культивировали наиболее инвазивный изолят S. sclerotiorum (изолят № 3), разрезав один склероций пополам, поместив его лицевой стороной вниз на среду PDA и инкубируя при 25°C в постоянной темноте (24 ч) в течение 4 дней для стимуляции роста мицелия. Затем с переднего края брали четыре агаровых диска диаметром 5 мм и инокулировали 100 г стерильной смеси пшеничных и рисовых отрубей (1:1, об/об), после чего все колбы инкубировали при 25 ± 2 °C в условиях 12-часового светового/12-часового темного цикла в течение 5 дней для стимуляции образования склероций. Содержимое всех колб тщательно перемешивали для обеспечения однородности перед добавлением почвы. Затем в каждый горшок добавляли 100 г колонизирующей отрубной смеси для обеспечения постоянной концентрации патогенов. Горшки с инокулированными грибами поливали для активации роста грибов и помещали в тепличные условия на 7 дней.
В каждый горшок высевали по пять семян сорта «Гиза 3». Для горшков, обработанных L-орнитином и фунгицидом «Ризолекс-Т», стерилизованные семена сначала замачивали в течение двух часов в водном растворе этих двух соединений с конечной концентрацией IC99 около 250 мг/л и 50 мг/л соответственно, а затем высушивали на воздухе в течение одного часа перед посевом. С другой стороны, в качестве отрицательного контроля семена замачивали в стерильной дистиллированной воде. Через 10 дней, перед первым поливом, всходы прореживали, оставляя в каждом горшке только два чистых саженца. Кроме того, для обеспечения заражения S. sclerotiorum, стебли фасоли на одной и той же стадии развития (10 дней) срезали в двух разных местах стерилизованным скальпелем, и в каждую рану помещали приблизительно 0,5 г колонизирующей смеси отрубей, после чего создавали высокую влажность для стимуляции заражения и развития болезни у всех инокулированных растений. Контрольные растения также были повреждены, и в рану было помещено равное количество (0,5 г) стерильной, неколонизированной смеси отрубей, после чего растения поддерживались в условиях высокой влажности для имитации среды развития болезни и обеспечения единообразия между группами обработки.
Метод обработки: рассаду фасоли поливали 500 мл водного раствора L-орнитина (250 мг/л) или фунгицида Ризолекс-Т (50 мг/л) путем полива почвы, затем обработку повторяли три раза с интервалом в 10 дней. Контрольные растения, получавшие плацебо, поливали 500 мл стерильной дистиллированной воды. Все обработки проводились в тепличных условиях (25 ± 2°C, 75 ± 1% относительной влажности и фотопериод 8 ч света/16 ч темноты). Все горшки поливали раз в две недели и ежемесячно обрабатывали сбалансированным NPK-удобрением (20-20-20, с 3,6% серы и микроэлементами TE; Zain Seeds, Египет) в концентрации 3–4 г/л путем внекорневой подкормки в соответствии с рекомендациями для конкретного сорта и инструкциями производителя. Если не указано иное, полностью распустившиеся зрелые листья (второй и третий листья сверху) собирали из каждой биологической повторности через 72 часа после обработки (чпт), гомогенизировали, объединяли и хранили при -80 °C для дальнейшего анализа, включая, помимо прочего, гистохимическую локализацию in situ индикаторов окислительного стресса, перекисного окисления липидов, ферментативных и неферментативных антиоксидантов и экспрессии генов.
Интенсивность поражения белой плесенью оценивали еженедельно через 21 день после инокуляции (дП) по шкале от 1 до 9 (дополнительная таблица S2), основанной на шкале Петцольдта и Диксона (1996), модифицированной Тераном и др. (2006). Вкратце, стебли и ветви бобовых растений осматривали, начиная с точки инокуляции, чтобы проследить распространение поражений вдоль междоузлий и узлов. Затем измеряли расстояние поражения от точки инокуляции до самой дальней точки вдоль стебля или ветви, и присваивали оценку от 1 до 9 в зависимости от местоположения поражения, где (1) означало отсутствие видимого поражения вблизи точки инокуляции, а (2–9) — постепенное увеличение размера поражения и его распространение вдоль узлов/междоузлий (дополнительная таблица S2). Интенсивность поражения белой плесенью затем переводили в проценты, используя формулу 2:
Кроме того, площадь под кривой прогрессирования заболевания (AUDPC) была рассчитана с использованием формулы (Шанер и Финни, 1977), которая недавно была адаптирована для белой гнили фасоли обыкновенной (Чаухан и др., 2020) с использованием уравнения 3:
Где Yi = степень тяжести заболевания в момент времени ti, Yi+1 = степень тяжести заболевания в следующий момент времени ti+1, ti = время первого измерения (в днях), ti+1 = время следующего измерения (в днях), n = общее количество временных точек или точек наблюдения. Параметры роста фасоли, включая высоту растения (см), количество ветвей на растении и количество листьев на растении, регистрировались еженедельно в течение 21 дня во всех биологических повторах.
В каждой биологической повторности образцы листьев (второй и третий полностью развитые листья сверху) собирали на 45-й день после обработки (через 15 дней после последней обработки). Каждая биологическая повторность состояла из пяти горшков (по два растения в горшке). Около 500 мг измельченной ткани использовали для экстракции фотосинтетических пигментов (хлорофилла а, хлорофилла b и каротиноидов) с использованием 80% ацетона при 4 °C в темноте. Через 24 часа образцы центрифугировали, и надосадочную жидкость собирали для колориметрического определения содержания хлорофилла а, хлорофилла b и каротиноидов с помощью спектрофотометра UV-160A (Shimadzu Corporation, Япония) по методу (Lichtenthaler, 1987) путем измерения поглощения на трех разных длинах волн (A470, A646 и A663 нм). Наконец, содержание фотосинтетических пигментов было рассчитано с использованием следующих формул 4–6, описанных Лихтенталером (1987).
Через 72 часа после обработки (чпт) листья (второй и третий полностью развитые листья сверху) были собраны из каждой биологической реплики для гистохимической локализации перекиси водорода (H2O2) и супероксид-аниона (O2•−) in situ. Каждая биологическая реплика состояла из пяти горшков (по два растения в горшке). Каждая биологическая реплика анализировалась в двух повторах (два технических повтора) для обеспечения точности, надежности и воспроизводимости метода. H2O2 и O2•− определяли с использованием 0,1% 3,3′-диаминобензидина (DAB; Sigma-Aldrich, Дармштадт, Германия) или нитросинего тетразолия (NBT; Sigma-Aldrich, Дармштадт, Германия) соответственно, согласно методам, описанным Ромеро-Пуэртасом и др. (2004) и Адамом и др. (1989) с небольшими изменениями. Для гистохимической локализации H2O2 in situ, створки клапанов вакуумно пропитывали 0,1% DAB в 10 мМ Трис-буфере (pH 7,8), а затем инкубировали при комнатной температуре на свету в течение 60 мин. Створки отбеливали в 0,15% (об/об) ТСА в смеси этанола и хлороформа в соотношении 4:1 (об/об) (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Каир, Египет), а затем подвергали воздействию света до потемнения. Аналогичным образом, для гистохимической локализации O2•− in situ, створки вакуумно пропитывали 10 мМ калий-фосфатным буфером (pH 7,8), содержащим 0,1 мас./об.% HBT. Створки инкубировали на свету при комнатной температуре в течение 20 мин, затем отбеливали, как описано выше, и затем освещали до появления темно-синих/фиолетовых пятен. Интенсивность полученного коричневого (в качестве индикатора H2O2) или сине-фиолетового (в качестве индикатора O2•−) цвета оценивали с помощью версии Fiji пакета обработки изображений ImageJ (http://fiji.sc; доступ осуществлен 7 марта 2024 г.).
Малоновый диальдегид (МДА; как маркер перекисного окисления липидов) определяли по методу Ду и Брамлейджа (1992) с небольшими модификациями. Листья из каждой биологической повторности (второй и третий полностью развитые листья сверху) собирали через 72 часа после обработки (чпт). Каждая биологическая повторность включала пять горшков (по два растения в горшке). Каждая биологическая повторность анализировалась в двух повторах (две технические повторности) для обеспечения точности, надежности и воспроизводимости метода. Вкратце, 0,5 г измельченной листовой ткани использовали для экстракции МДА с помощью 20% трихлоруксусной кислоты (ТХУ; MilliporeSigma, Берлингтон, Массачусетс, США), содержащей 0,01% бутилированного гидрокситолуола (БГТ; Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США). Содержание МДА в надосадочной жидкости затем определяли колориметрическим методом путем измерения поглощения при 532 и 600 нм с использованием спектрофотометра UV-160A (Shimadzu Corporation, Япония) и выражали в нмоль г−1 сырой массы.
Для оценки неферментативных и ферментативных антиоксидантов листья (второй и третий полностью развитые листья сверху) собирали из каждой биологической повторности через 72 часа после обработки (чпт). Каждая биологическая повторность состояла из пяти горшков (по два растения в горшке). Каждый биологический образец анализировали в двух повторах (два технических образца). Два листа измельчали ​​с помощью жидкого азота и использовали непосредственно для определения ферментативных и неферментативных антиоксидантов, общего содержания аминокислот, содержания пролина, экспрессии генов и количественного определения оксалата.
Общее содержание растворимых фенольных соединений определяли с использованием реактива Фолина-Циокалтеу (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) с небольшими модификациями метода, описанного Кахконеном и др. (1999). Вкратце, приблизительно 0,1 г гомогенизированной листовой ткани экстрагировали 20 мл 80% метанола в темноте в течение 24 часов, после чего центрифугировали надосадочную жидкость. 0,1 мл экстракта образца смешивали с 0,5 мл реактива Фолина-Циокалтеу (10%), встряхивали в течение 30 секунд и оставляли в темноте на 5 минут. Затем в каждую пробирку добавляли 0,5 мл 20% раствора карбоната натрия (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Каир, Египет), тщательно перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в темноте в течение 1 часа. После инкубации абсорбцию реакционной смеси измеряли при 765 нм с помощью спектрофотометра UV-160A (Shimadzu Corporation, Япония). Концентрацию общих растворимых фенолов в экстрактах образцов определяли с использованием калибровочной кривой галловой кислоты (Fisher Scientific, Хэмптон, Нью-Гэмпшир, США) и выражали в миллиграммах галловой кислоты в эквиваленте на грамм свежей массы (мг ГАЭ г⁻¹ свежей массы).
Общее содержание растворимых флавоноидов определяли по методу Джеридане и др. (2006) с небольшими модификациями. Вкратце, 0,3 мл вышеуказанного метанольного экстракта смешивали с 0,3 мл 5% раствора хлорида алюминия (AlCl3; Fisher Scientific, Хэмптон, Нью-Гэмпшир, США), энергично перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 5 минут, после чего добавляли 0,3 мл 10% раствора ацетата калия (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Каир, Египет), тщательно перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут в темноте. После инкубации измеряли поглощение реакционной смеси при 430 нм с помощью спектрофотометра UV-160A (Shimadzu Corporation, Япония). Концентрацию суммарных растворимых флавоноидов в экстрактах образцов определяли с помощью калибровочной кривой рутина (TCI America, Портленд, Орегон, США), а затем выражали в миллиграммах рутинового эквивалента на грамм свежей массы (мг RE г-1 свежей массы).
Общее содержание свободных аминокислот в листьях фасоли определяли с использованием модифицированного нингидринового реагента (Thermo Scientific Chemicals, Уолтем, Массачусетс, США) на основе метода, предложенного Йокоямой и Хирамацу (2003 г.) и модифицированного Суном и др. (2006 г.). Вкратце, 0,1 г измельченной ткани экстрагировали буфером с pH 5,4, 200 мкл супернатанта смешивали с 200 мкл нингидрина (2%) и 200 мкл пиридина (10%; Spectrum Chemical, Нью-Брансуик, Нью-Джерси, США), инкубировали в кипящей водяной бане в течение 30 мин, затем охлаждали и измеряли при 580 нм с помощью спектрофотометра UV-160A (Shimadzu Corporation, Япония). С другой стороны, содержание пролина определяли методом Бейтса (Bates et al., 1973). Пролин экстрагировали 3%-ным раствором сульфосалициловой кислоты (Thermo Scientific Chemicals, Уолтем, Массачусетс, США), после центрифугирования 0,5 мл супернатанта смешивали с 1 мл ледяной уксусной кислоты (Fisher Scientific, Хэмптон, Нью-Гэмпшир, США) и нингидриновым реактивом, инкубировали при 90°C в течение 45 мин, охлаждали и измеряли при 520 нм с использованием того же спектрофотометра, что и выше. Общее содержание свободных аминокислот и пролина в экстрактах листьев определяли с использованием калибровочных кривых глицина и пролина (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) соответственно и выражали в мг/г свежей массы.
Для определения ферментативной активности антиоксидантных ферментов приблизительно 500 мг гомогенизированной ткани экстрагировали 3 мл 50 мМ Трис-буфера (pH 7,8), содержащего 1 мМ ЭДТА-Na2 (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) и 7,5% поливинилпирролидона (ПВП; Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США), центрифугировали при 10 000 × g в течение 20 мин в условиях охлаждения (4 °C), после чего собирали супернатант (неочищенный ферментный экстракт) (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Затем каталазу (CAT) обрабатывали 2 мл 0,1 М фосфатного буфера натрия (pH 6,5; Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) и 100 мкл 269 мМ раствора H2O2 для определения ее ферментативной активности по методу Эби (1984) с небольшими модификациями (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Ферментативную активность гваякол-зависимой пероксидазы (POX) определяли по методу Харраха и др. (2009). Метод (2008 г.) с небольшими изменениями (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) и ферментативная активность полифенолоксидазы (PPO) определялись после реакции с 2,2 мл 100 мМ фосфатного буфера натрия (pH 6,0), 100 мкл гваякола (TCI chemicals, Портленд, Орегон, США) и 100 мкл 12 мМ H2O2. Метод был немного модифицирован по сравнению с (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Анализ проводился после реакции с 3 мл раствора катехола (Thermo Scientific Chemicals, Уолтем, Массачусетс, США) (0,01 М), свежеприготовленного в 0,1 М фосфатном буфере (pH 6,0). Активность CAT измеряли путем мониторинга разложения H2O2 при 240 нм (A240), активность POX измеряли путем мониторинга увеличения поглощения при 436 нм (A436), а активность PPO измеряли путем регистрации колебаний поглощения при 495 нм (A495) каждые 30 с в течение 3 мин с использованием спектрофотометра UV-160A (Shimadzu, Япония).
Для определения уровня транскрипции трех генов, связанных с антиоксидантной защитой, включая пероксисомальную каталазу (PvCAT1; номер доступа GenBank KF033307.1), супероксиддисмутазу (PvSOD; номер доступа GenBank XM_068639556.1) и глутатионредуктазу (PvGR; номер доступа GenBank KY195009.1), в листьях фасоли (второй и третий полностью развитые листья сверху) через 72 часа после последней обработки использовали ПЦР в реальном времени. Кратко, РНК выделяли с помощью набора Simply P Total RNA Extraction Kit (кат. № BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, Китай) в соответствии с протоколом производителя. Затем синтез кДНК проводили с использованием набора TOP script™ cDNA Synthesis Kit в соответствии с инструкциями производителя. Последовательности праймеров для вышеуказанных трех генов приведены в дополнительной таблице S3. В качестве гена домашнего хозяйства использовался PvActin-3 (номер доступа GenBank: XM_068616709.1), а относительная экспрессия гена рассчитывалась с использованием метода 2-ΔΔCT (Livak and Schmittgen, 2001). Была продемонстрирована стабильность актина в условиях биотического стресса (несовместимое взаимодействие между обычными бобовыми и грибом антракноза Colletotrichum lindemuthianum) и абиотического стресса (засуха, засоление, низкая температура) (Borges et al., 2012).
Первоначально мы провели полногеномный in silico анализ белков оксалоацетат-ацетилгидролазы (OAH) в S. sclerotiorum с использованием инструмента BLAST для поиска белков (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005). Вкратце, мы использовали OAH из Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; таксид: 1191702; номер доступа GenBank XP_040799428.1; 342 аминокислоты) и Penicillium lagena (PlOAH; таксид: 94218; номер доступа GenBank XP_056833920.1; 316 аминокислот) в качестве последовательностей-запросов для картирования гомологичного белка в S. sclerotiorum (таксид: 5180). Поиск с помощью BLASTp был выполнен по самым последним доступным данным генома S. sclerotiorum в базе данных GenBank на веб-сайте Национального центра биотехнологической информации (NCBI), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
Кроме того, предсказанный ген OAH из S. sclerotiorum (SsOAH), а также эволюционный анализ и филогенетическое дерево AfOAH из A. fijiensis CBS 313.89 и PlOAH из P. lagena были построены с использованием метода максимального правдоподобия в MEGA11 (Tamura et al., 2021) и матричной модели JTT (Jones et al., 1992). Филогенетическое дерево было объединено с анализом множественного выравнивания белковых последовательностей всех предсказанных генов OAH (SsOAH) из S. sclerotiorum и последовательности запроса с использованием инструмента выравнивания на основе ограничений (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos and Agarwala, 2007). Кроме того, наиболее подходящие аминокислотные последовательности SsOAH из S. sclerotiorum были выровнены с последовательностями запроса (AfOAH и PlOAH) (Larkin et al., 2007) с использованием ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw), а консервативные регионы в выравнивании были визуализированы с помощью инструмента ESPript (версия 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php).
Кроме того, предсказанные функциональные репрезентативные домены и консервативные участки S. sclerotiorum SsOAH были интерактивно классифицированы по различным семействам с использованием инструмента InterPro (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021). Наконец, трехмерное (3D) моделирование структуры предсказанного S. sclerotiorum SsOAH было выполнено с использованием механизма распознавания гомологии/аналогии белков (сервер Phyre2 версии 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) и подтверждено с помощью сервера SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014). Предсказанные трехмерные структуры (в формате PDB) были интерактивно визуализированы с помощью пакета UCSF-Chimera (версия 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ ) (Pettersen et al., 2004).
Для определения уровня транскрипции оксалоацетат-ацетилгидролазы (SsOAH; номер доступа GenBank: XM_001590428.1) в мицелии Sclerotinia sclerotiorum использовали количественную ПЦР в реальном времени с флуоресцентной детекцией. Вкратце, S. sclerotiorum инокулировали в колбу, содержащую PDB, и помещали в шейкер-инкубатор (модель: I2400, New Brunswick Scientific Co., Эдисон, Нью-Джерси, США) при температуре 25 ± 2 °C на 24 часа при 150 об/мин и постоянной темноте (24 часа) для стимуляции роста мицелия. После этого клетки обрабатывали L-орнитином и фунгицидом Rizolex-T в конечных концентрациях IC50 (приблизительно 40 и 3,2 мг/л соответственно), а затем культивировали еще 24 часа в тех же условиях. После инкубации культуры центрифугировали при 2500 об/мин в течение 5 мин, и супернатант (мицелий гриба) собирали для анализа экспрессии генов. Аналогичным образом мицелий гриба собирали через 0, 24, 48, 72, 96 и 120 ч после заражения с зараженных растений, у которых на поверхности зараженных тканей образовалась белая плесень и ватообразный мицелий. Из мицелия гриба выделяли РНК, а затем синтезировали кДНК, как описано выше. Последовательности праймеров для SsOAH приведены в дополнительной таблице S3. В качестве гена домашнего хозяйства использовали SsActin (номер доступа GenBank: XM_001589919.1), а относительную экспрессию гена рассчитывали с использованием метода 2-ΔΔCT (Livak and Schmittgen, 2001).
Содержание щавелевой кислоты определяли в картофельно-декстрозном бульоне (PDB) и образцах растений, содержащих патогенный гриб Sclerotinia sclerotiorum, согласно методу Сюй и Чжана (2000) с небольшими модификациями. Вкратце, изоляты S. sclerotiorum инокулировали в колбы, содержащие PDB, а затем культивировали в шейкерном инкубаторе (модель I2400, New Brunswick Scientific Co., Эдисон, Нью-Джерси, США) при 150 об/мин при 25 ± 2 °C в течение 3–5 дней в постоянной темноте (24 ч) для стимуляции роста мицелия. После инкубации грибковую культуру сначала фильтровали через фильтровальную бумагу Whatman № 1, а затем центрифугировали при 2500 об/мин в течение 5 мин для удаления остатков мицелия. Надосадочную жидкость собирали и хранили при 4 °C для дальнейшего количественного определения оксалата. Для подготовки образцов растений приблизительно 0,1 г фрагментов растительной ткани трижды экстрагировали дистиллированной водой (по 2 мл каждый раз). Затем образцы центрифугировали при 2500 об/мин в течение 5 мин, надосадочную жидкость фильтровали через фильтровальную бумагу Whatman № 1 и собирали для дальнейшего анализа.
Для количественного анализа щавелевой кислоты реакционную смесь готовили в стеклянной пробирке с пробкой в ​​следующем порядке: 0,2 мл образца (или фильтрата культуры PDB или стандартного раствора щавелевой кислоты), 0,11 мл бромфенолового синего (BPB, 1 мМ; Fisher Chemical, Питтсбург, Пенсильвания, США), 0,198 мл 1 М серной кислоты (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Каир, Египет) и 0,176 мл 100 мМ дихромата калия (K2Cr2O7; TCI chemicals, Портленд, Орегон, США), затем раствор разбавляли дистиллированной водой до 4,8 мл, энергично перемешивали и немедленно помещали в водяную баню при 60 °C. Через 10 мин реакцию останавливали добавлением 0,5 мл раствора гидроксида натрия (NaOH; 0,75 М). Абсорбцию (A600) реакционной смеси измеряли при 600 нм с помощью спектрофотометра UV-160 (Shimadzu Corporation, Япония). В качестве контролей для количественного определения культуральных фильтратов и образцов растений использовали PDB и дистиллированную воду соответственно. Концентрации щавелевой кислоты в культуральных фильтратах, выраженные в микрограммах щавелевой кислоты на миллилитр среды PDB (мкг·мл−1), и в экстрактах листьев, выраженные в микрограммах щавелевой кислоты на грамм свежей массы (мкг·г−1 СМ), определяли с помощью калибровочной кривой щавелевой кислоты (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Уолтем, Массачусетс, США).
В ходе исследования все эксперименты проводились по схеме полностью рандомизированного дизайна (CRD) с шестью биологическими повторами на каждый вариант обработки и пятью горшками на каждый биологический повтор (два растения в горшке), если не указано иное. Биологические повторы анализировались в двух повторах (два технических повтора). Технические повторы использовались для проверки воспроизводимости одного и того же эксперимента, но не использовались в статистическом анализе, чтобы избежать ложных повторов. Данные были статистически проанализированы с использованием дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим применением критерия Тьюки-Крамера для определения достоверно значимых различий (HSD) (p ≤ 0,05). Для экспериментов in vitro значения IC50 и IC99 рассчитывались с использованием пробит-модели, и были рассчитаны 95% доверительные интервалы.
В общей сложности было собрано четыре изолята с разных соевых полей в провинции Эль-Габия, Египет. На среде PDA все изоляты образовывали кремово-белый мицелий, который быстро становился ватообразно-белым (рис. 1А), а затем бежевым или коричневым на стадии склероция. Склероции обычно плотные, черные, сферические или неправильной формы, длиной от 5,2 до 7,7 мм и диаметром от 3,4 до 5,3 мм (рис. 1B). Хотя у четырех изолятов после 10–12 дней инкубации при 25 ± 2 °C на краю культуральной среды развивался краевой рисунок склероций (рис. 1А), количество склероций на чашке Петри значительно различалось между ними (P < 0,001), при этом у изолята 3 было наибольшее количество склероций (32,33 ± 1,53 склероций на чашке Петри; рис. 1C). Аналогично, изолят №3 продуцировал больше щавелевой кислоты на среде PDB, чем другие изоляты (3,33 ± 0,49 мкг/мл; рис. 1D). Изолят №3 демонстрировал типичные морфологические и микроскопические характеристики фитопатогенного гриба Sclerotinia sclerotiorum. Например, на среде PDA колонии изолята №3 быстро росли, были кремово-белыми (рис. 1A), с обратной стороной бежевого или светло-лососево-желто-коричневого цвета и требовали 6-7 дней при температуре 25 ± 2°C для полного покрытия поверхности чашки Петри диаметром 9 см. На основании вышеуказанных морфологических и микроскопических характеристик изолят №3 был идентифицирован как Sclerotinia sclerotiorum.
Рисунок 1. Характеристики и патогенность изолятов S. sclerotiorum из распространенных бобовых культур. (A) Рост мицелия четырех изолятов S. sclerotiorum на среде PDA, (B) склероции четырех изолятов S. sclerotiorum, (C) количество склероций (на чашку Петри), (D) секреция щавелевой кислоты на среде PDB (мкг·мл−1) и (E) степень поражения (%) четырьмя изолятами S. sclerotiorum на восприимчивом коммерческом сорте бобовых Giza 3 в условиях теплицы. Значения представляют собой среднее ± стандартное отклонение пяти биологических повторений (n = 5). Различные буквы указывают на статистически значимые различия между вариантами обработки (p < 0,05). (F–H) Типичные симптомы белой плесени появились на надземных стеблях и стручках соответственно через 10 дней после инокуляции изолятом № 3 (дпн). (I) Эволюционный анализ области внутреннего транскрибируемого спейсера (ITS) изолята S. sclerotiorum № 3 был выполнен с использованием метода максимального правдоподобия и сравнен с 20 эталонными изолятами/штаммами, полученными из базы данных Национального центра биотехнологической информации (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Числа над линиями кластеризации указывают на охват области (%), а числа под линиями кластеризации указывают на длину ветви.
Кроме того, для подтверждения патогенности четыре полученных изолята S. sclerotiorum были использованы для инокуляции восприимчивого коммерческого сорта фасоли Giza 3 в условиях теплицы, что соответствует постулатам Коха (рис. 1E). Хотя все полученные изоляты грибов были патогенными и могли инфицировать зеленую фасоль (сорт Giza 3), вызывая типичные симптомы белой плесени на всех надземных частях (рис. 1F), особенно на стеблях (рис. 1G) и стручках (рис. 1H) через 10 дней после инокуляции (дп.и.), изолят 3 оказался наиболее агрессивным изолятом в двух независимых экспериментах. Изолят 3 показал самую высокую степень поражения (%) на растениях фасоли (24,0 ± 4,0, 58,0 ± 2,0 и 76,7 ± 3,1 через 7, 14 и 21 день после заражения соответственно; рис. 1F).
Идентификация наиболее инвазивного изолята S. sclerotiorum № 3 была дополнительно подтверждена на основе секвенирования внутреннего транскрибируемого спейсера (ITS) (рис. 1I). Филогенетический анализ между изолятом № 3 и 20 референсными изолятами/штаммами показал высокое сходство (>99%) между ними. Стоит отметить, что изолят S. sclerotiorum № 3 (533 п.н.) имеет высокое сходство с американским изолятом S. sclerotiorum LPM36, выделенным из сухих семян гороха (номер доступа GenBank MK896659.1; 540 п.н.), и китайским изолятом S. sclerotiorum YKY211 (номер доступа GenBank OR206374.1; 548 п.н.), вызывающим фиолетовую (Matthiola incana) гниль стебля, все из которых сгруппированы отдельно в верхней части дендрограммы (рис. 1I). Новая последовательность депонирована в базе данных NCBI и названа «Sclerotinia sclerotiorum – изолят YN-25» (номер доступа GenBank PV202792). Видно, что изолят 3 является наиболее инвазивным; поэтому именно этот изолят был выбран для исследования во всех последующих экспериментах.
В условиях in vitro была исследована антибактериальная активность диамина L-орнитина (Sigma-Aldrich, Дармштадт, Германия) в различных концентрациях (12,5, 25, 50, 75, 100 и 125 мг/л) против изолята S. sclerotiorum 3. Следует отметить, что L-орнитин оказывал антибактериальное действие и постепенно ингибировал радиальный рост гиф S. sclerotiorum в зависимости от дозы (рис. 2А, В). При самой высокой исследованной концентрации (125 мг/л) L-орнитин продемонстрировал самый высокий уровень ингибирования роста мицелия (99,62 ± 0,27%; рис. 2В), что эквивалентно коммерческому фунгициду Rizolex-T (уровень ингибирования 99,45 ± 0,39%; рис. 2С) при самой высокой исследованной концентрации (10 мг/л), указывая на аналогичную эффективность.
Рисунок 2. Антибактериальная активность L-орнитина in vitro против Sclerotinia sclerotiorum. (A) Сравнение антибактериальной активности различных концентраций L-орнитина против S. sclerotiorum с коммерческим фунгицидом Rizolex-T (10 мг/л). (B, C) Степень ингибирования (%) роста мицелия S. sclerotiorum после обработки различными концентрациями L-орнитина (12,5, 25, 50, 75, 100 и 125 мг/л) или Rizolex-T (2, 4, 6, 8 и 10 мг/л) соответственно. Значения представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение пяти биологических повторов (n = 5). Различные буквы обозначают статистически значимые различия между вариантами обработки (p < 0,05). (D, E) Регрессионный анализ пробит-модели L-орнитина и коммерческого фунгицида Ризолекс-Т соответственно. Линия регрессии пробит-модели показана сплошной синей линией, а доверительный интервал (95%) — пунктирной красной линией.
Кроме того, был проведен пробит-регрессионный анализ, соответствующие графики которого представлены в таблице 1 и на рисунках 2D и 2E. Вкратце, приемлемое значение наклона (y = 2,92x − 4,67) и соответствующие статистические показатели значимости (коэффициент детерминации Кокса и Снелла R2 = 0,3709, коэффициент детерминации Нагелькерке R2 = 0,4998 и p < 0,0001; рисунок 2D) L-орнитина указывают на повышенную противогрибковую активность против S. sclerotiorum по сравнению с коммерческим фунгицидом Rizolex-T (y = 1,96x − 0,99, коэффициент детерминации Кокса и Снелла R2 = 0,1242, коэффициент детерминации Нагелькерке R2 = 0,1708 и p < 0,0001) (таблица 1).
Таблица 1. Значения полумаксимальной ингибирующей концентрации (IC50) и IC99 (мг/л) L-орнитина и коммерческого фунгицида «Ризолекс-Т» против S. sclerotiorum.
В целом, L-орнитин (250 мг/л) значительно снизил развитие и тяжесть белой плесени на обработанных растениях фасоли обыкновенной по сравнению с необработанными растениями, зараженными S. sclerotiorum (контроль; рис. 3А). Вкратце, хотя тяжесть заболевания на необработанных зараженных контрольных растениях постепенно увеличивалась (52,67 ± 1,53, 83,21 ± 2,61 и 92,33 ± 3,06%), L-орнитин значительно снизил тяжесть заболевания (%) на протяжении всего эксперимента (8,97 ± 0,15, 18,00 ± 1,00 и 26,36 ± 3,07) через 7, 14 и 21 день после обработки (дпт) соответственно (рис. 3А). Аналогично, при обработке зараженных S. sclerotiorum растений фасоли 250 мг/л L-орнитином площадь под кривой прогрессирования заболевания (AUDPC) снизилась с 1274,33 ± 33,13 в необработанном контроле до 281,03 ± 7,95, что было немного ниже, чем в положительном контроле с фунгицидом Rizolex-T 50 мг/л (183,61 ± 7,71; рис. 3B). Та же тенденция наблюдалась и во втором эксперименте.
Рис. 3. Влияние экзогенного применения L-орнитина на развитие белой гнили фасоли обыкновенной, вызываемой Sclerotinia sclerotiorum, в условиях теплицы. (A) Кривая развития белой гнили фасоли обыкновенной после обработки 250 мг/л L-орнитина. (B) Площадь под кривой развития белой гнили фасоли обыкновенной после обработки L-орнитином. Значения представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение пяти биологических повторений (n = 5). Различные буквы обозначают статистически значимые различия между вариантами обработки (p < 0,05).
Экзогенное применение 250 мг/л L-орнитина постепенно увеличивало высоту растений (рис. 4А), количество ветвей на растении (рис. 4В) и количество листьев на растении (рис. 4С) через 42 дня. В то время как коммерческий фунгицид Ризолекс-Т (50 мг/л) оказывал наибольшее влияние на все изученные параметры питания, экзогенное применение 250 мг/л L-орнитина оказывало второе по величине влияние по сравнению с необработанными контрольными образцами (рис. 4А–С). С другой стороны, обработка L-орнитином не оказала существенного влияния на содержание фотосинтетических пигментов хлорофилла а (рис. 4D) и хлорофилла b (рис. 4E), но незначительно увеличила общее содержание каротиноидов (0,56 ± 0,03 мг/г сырой массы) по сравнению с отрицательным контролем (0,44 ± 0,02 мг/г сырой массы) и положительным контролем (0,46 ± 0,02 мг/г сырой массы; рис. 4F). В целом, эти результаты показывают, что L-орнитин не является фитотоксичным для обработанных бобовых и может даже стимулировать их рост.
Рис. 4. Влияние применения экзогенного L-орнитина на характеристики роста и фотосинтетические пигменты листьев фасоли, зараженных Sclerotinia sclerotiorum в условиях теплицы. (A) Высота растения (см), (B) Количество ветвей на растении, (C) Количество листьев на растении, (D) Содержание хлорофилла а (мг г⁻¹ от массы), (E) Содержание хлорофилла b (мг г⁻¹ от массы), (F) Общее содержание каротиноидов (мг г⁻¹ от массы). Значения представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение пяти биологических повторений (n = 5). Различные буквы указывают на статистически значимые различия между вариантами обработки (p < 0,05).
Гистохимическая локализация активных форм кислорода (АФК; выраженных как перекись водорода [H2O2]) и свободных радикалов (выраженных как супероксидные анионы [O2•−]) in situ показала, что экзогенное применение L-орнитина (250 мг/л) значительно снизило накопление H2O2 (96,05 ± 5,33 нмоль·г−1 сырой массы; рис. 5А) и O2•− (32,69 ± 8,56 нмоль·г−1 сырой массы; рис. 5B) по сравнению с накоплением как в необработанных зараженных растениях (173,31 ± 12,06 и 149,35 ± 7,94 нмоль·г−1 сырой массы соответственно), так и в растениях, обработанных 50 мг/л коммерческого фунгицида Rizolex-T (170,12 ± 9,50 и 157,00 ± 7,81 нмоль·г−1 от массы тела соответственно) через 72 ч. Высокие уровни H2O2 и O2•− накапливались при hpt (рис. 5A, B). Аналогично, анализ малонового диальдегида (МДА) на основе ТСА показал, что зараженные S. sclerotiorum растения фасоли накапливали более высокие уровни МДА (113,48 ± 10,02 нмоль·г−1 от массы тела) в своих листьях (рис. 5C). Однако экзогенное применение L-орнитина значительно снизило перекисное окисление липидов, о чем свидетельствует снижение содержания МДА в обработанных растениях (33,08 ± 4,00 нмоль·г−1 от массы тела).
Рис. 5. Влияние применения экзогенного L-орнитина на основные маркеры окислительного стресса и неферментативные механизмы антиоксидантной защиты в листьях фасоли, зараженных S. sclerotiorum, через 72 часа после заражения в условиях теплицы. (A) Перекись водорода (H2O2; нмоль г−1 сырой массы) через 72 ч после обработки, (B) супероксидный анион (O2•−; нмоль г−1 сырой массы) через 72 ч после обработки, (C) малоновый диальдегид (МДА; нмоль г−1 сырой массы) через 72 ч после обработки, (D) общее содержание растворимых фенолов (мг ГАЭ г−1 сырой массы) через 72 ч после обработки, (E) общее содержание растворимых флавоноидов (мг РЭ г−1 сырой массы) через 72 ч после обработки, (F) общее содержание свободных аминокислот (мг г−1 сырой массы) через 72 ч после обработки и (G) содержание пролина (мг г−1 сырой массы) через 72 ч после обработки. Значения представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение (среднее ± SD) для 5 биологических повторов (n = 5). Различные буквы указывают на статистически значимые различия между вариантами лечения (p < 0,05).