Различные теории защиты растений предоставляют важные теоретические ориентиры для объяснения закономерностей специализированного метаболизма растений, но их ключевые предсказания еще предстоит проверить. В данном исследовании мы использовали непредвзятый тандемный масс-спектрометрический анализ (MS/MS) для систематического изучения метаболома ослабленных штаммов табака, от отдельных растений до популяций и близкородственных видов, и обработали большое количество теорий характеристик масс-спектрометрии, основанных на спектрах соединений, в рамках информационной структуры для проверки ключевых предсказаний теорий оптимальной защиты (OD) и движущейся мишени (MT). Информационный компонент метаболомики растений согласуется с теорией OD, но противоречит основному предсказанию теории MT относительно динамики метаболомики, вызванной травоядными животными. От микро- до макроэволюционного масштаба сигнал жасмоната был идентифицирован как основной детерминант OD, в то время как сигнал этилена обеспечивал тонкую настройку специфической для травоядных животных реакции, аннотированной молекулярной сетью MS/MS.
Специальные метаболиты с разнообразной структурой являются основными участниками адаптации растений к окружающей среде, особенно в защите от врагов (1). Удивительное разнообразие специального метаболизма, обнаруженного у растений, стимулировало десятилетия углубленных исследований его многочисленных аспектов экологических функций и сформировало длинный список теорий защиты растений, которые представляют собой эволюционное и экологическое развитие взаимодействий растений и насекомых. Эмпирические исследования дают важное руководство (2). Однако эти теории защиты растений не следовали нормативному пути гипотетического дедуктивного рассуждения, в котором ключевые предсказания находились на одном уровне анализа (3) и проверялись экспериментально для продвижения следующего цикла теоретического развития (4). Технические ограничения ограничивают сбор данных определенными метаболическими категориями и исключают всесторонний анализ специализированных метаболитов, тем самым препятствуя межкатегорийным сравнениям, которые необходимы для теоретического развития (5). Отсутствие всесторонних метаболомических данных и общего инструмента для сравнения рабочих процессов обработки метаболического пространства между различными группами растений препятствует научной зрелости этой области.
Последние достижения в области тандемной масс-спектрометрии (МС/МС) метаболомики позволяют всесторонне охарактеризовать метаболические изменения внутри и между видами данной системной клады и могут быть объединены с вычислительными методами для расчета структурного сходства между этими сложными смесями. Предварительные знания в области химии (5). Сочетание передовых технологий анализа и вычислений обеспечивает необходимую основу для долгосрочной проверки многих предсказаний, сделанных экологическими и эволюционными теориями метаболического разнообразия. Шеннон (6) впервые ввел теорию информации в своей основополагающей статье в 1948 году, заложив основу для математического анализа информации, которая использовалась во многих областях, помимо ее первоначального применения. В геномике теория информации успешно применялась для количественной оценки информации, сохраняющей последовательность (7). В транскриптомных исследованиях теория информации анализирует общие изменения в транскриптоме (8). В предыдущих исследованиях мы применили статистическую основу теории информации к метаболомике для описания метаболической экспертизы на тканевом уровне у растений (9). В данном исследовании мы объединяем рабочий процесс на основе MS/MS со статистической моделью теории информации, характеризующейся метаболическим разнообразием в общей валюте, чтобы сравнить ключевые предсказания теории защиты растений от воздействия травоядных животных на метаболом.
Теоретические основы защиты растений обычно взаимоисключающие и могут быть разделены на две категории: те, которые пытаются объяснить распределение специфических для растений метаболитов на основе защитных функций, такие как теория оптимальной защиты (OD) (10), теория движущейся цели (MT) (11) и теория появления (12), в то время как другие ищут механические объяснения того, как изменения доступности ресурсов влияют на рост растений и накопление специализированных метаболитов, таких как углерод: гипотеза баланса питательных веществ (13), гипотеза скорости роста (14) и гипотеза равновесия роста и дифференциации (15). Эти два набора теорий находятся на разных уровнях анализа (4). Однако две теории, включающие защитные функции на функциональном уровне, доминируют в обсуждении конститутивной и индуцируемой защиты растений: теория OD, которая предполагает, что растения инвестируют в свою дорогостоящую химическую защиту только тогда, когда это необходимо, например, когда они попадают в организм. Когда нападает травянистое животное, то, в зависимости от возможности будущей атаки, назначается соединение с защитной функцией (10); Гипотеза МТ предполагает, что нет оси направленного изменения метаболитов, а метаболиты изменяются случайным образом, создавая тем самым возможность препятствовать метаболической «цели движения» атакующих травоядных. Другими словами, эти две теории делают противоположные предсказания относительно метаболической перестройки, которая происходит после нападения травоядных: взаимосвязь между однонаправленным накоплением метаболитов с защитной функцией (OD) и ненаправленными метаболическими изменениями (MT) (11).
Гипотезы OD и MT включают не только индуцированные изменения в метаболоме, но и экологические и эволюционные последствия накопления этих метаболитов, такие как адаптивные издержки и выгоды этих метаболических изменений в конкретной экологической среде (16). Хотя обе гипотезы признают защитную функцию специализированных метаболитов, которые могут быть как дорогостоящими, так и недорогими, ключевое предсказание, отличающее гипотезы OD и MT, заключается в направленности индуцированных метаболических изменений. Предсказание теории OD до сих пор привлекало наибольшее экспериментальное внимание. Эти проверки включают изучение прямых или косвенных защитных функций различных тканей от специфических соединений в теплицах и естественных условиях, а также изменения стадии развития растений (17-19). Однако до сих пор из-за отсутствия рабочего процесса и статистической основы для глобального всестороннего анализа метаболического разнообразия любого организма основное различие между двумя теориями (то есть, направление метаболических изменений) остается непроверенным. Здесь мы предлагаем такой анализ.
Одной из наиболее значимых характеристик специфических для растений метаболитов является их чрезвычайное структурное разнообразие на всех уровнях, от отдельных растений и популяций до сходных видов (20). Многие количественные изменения в специализированных метаболитах можно наблюдать на уровне популяции, в то время как сильные качественные различия обычно сохраняются на уровне вида (20). Таким образом, метаболическое разнообразие растений является основным аспектом функционального разнообразия, отражающим адаптивность к различным нишам, особенно к тем нишам, где существуют различные возможности вторжения со стороны определенных насекомых и обычных травоядных (21). Со времен новаторской статьи Френкеля (22) о причинах существования специфических для растений метаболитов, взаимодействие с различными насекомыми рассматривается как важный фактор отбора, и считается, что эти взаимодействия сформировали растения в процессе эволюции. Метаболический путь (23). Межвидовые различия в разнообразии специализированных метаболитов могут также отражать физиологический баланс, связанный с конститутивной и индуцируемой защитой растений от травоядных стратегий, поскольку два вида часто отрицательно коррелируют друг с другом (24). Хотя поддержание хорошей защиты может быть полезным в любое время, своевременные метаболические изменения, связанные с защитой, обеспечивают явные преимущества, позволяя растениям направлять ценные ресурсы на другие физиологические затраты (19, 24) и избегать необходимости в симбиозе. Сопутствующий ущерб (25). Кроме того, эти реорганизации специализированных метаболитов, вызванные насекомыми-фитофагами, могут привести к деструктивному распределению в популяции (26) и могут отражать прямые показания существенных естественных изменений в сигнале жасмоновой кислоты (ЖК), которые могут поддерживаться в популяции. Высокие и низкие сигналы ЖК представляют собой компромисс между защитой от фитофагов и конкуренцией с определенными видами (27). Кроме того, специализированные пути биосинтеза метаболитов будут быстро утрачиваться и трансформироваться в процессе эволюции, что приведет к неравномерному распределению метаболизма среди близкородственных видов (28). Эти полиморфизмы могут быстро устанавливаться в ответ на изменение моделей поведения фитофагов (29), что означает, что колебания сообществ фитофагов являются ключевым фактором, определяющим метаболическую гетерогенность.
Здесь мы конкретно решили следующие проблемы: (I) Как травоядное насекомое перестраивает метаболом растений? (II) Какие основные информационные компоненты метаболической пластичности можно количественно оценить для проверки предсказаний теории долгосрочной защиты? (III) Перепрограммируется ли метаболом растений уникальным для нападающего образом, и если да, то какую роль играют растительные гормоны в формировании специфического метаболического ответа, и какие метаболиты способствуют видовой специфичности защиты? (IV) Поскольку предсказания многих теорий защиты могут быть распространены на все уровни биологических тканей, мы задались вопросом, насколько согласован вызванный метаболический ответ при сравнении внутри вида с межвидовым сравнением? С этой целью мы систематически изучали метаболом листьев табака, являющегося экологической модельной культурой с богатым специализированным метаболизмом и эффективного против личинок двух местных травоядных насекомых: чешуекрылых Datura (Ms) (очень агрессивные, в основном поедаются) на растениях семейств Solanaceae и Spodoptera littoralis (Sl). Хлопковые листовые черви представляют собой своего рода «род», питающийся растениями семейства Solanaceae и другими родами и семействами. Мы проанализировали спектр метаболомики MS/MS и извлекли статистические дескрипторы теории информации для сравнения теорий OD и MT. Были созданы карты специфичности для выявления идентичности ключевых метаболитов. Анализ был расширен на местную популяцию N. nasi и близкородственные виды табака для дальнейшего анализа ковариации между сигнализацией растительных гормонов и индукцией OD.
Для получения общей карты пластичности и структуры метаболома листьев травоядного табака мы использовали ранее разработанный алгоритм анализа и вычислений для всестороннего сбора и деконволюции высокоразрешенных независимых MS/MS-спектров из растительных экстрактов (9). Этот недифференцированный метод (называемый MS/MS) позволяет создавать не избыточные спектры соединений, которые затем могут быть использованы для всех описанных здесь анализов на уровне соединений. Эти деконволюированные метаболиты растений имеют различные типы, состоящие из сотен и тысяч метаболитов (здесь около 500-1000 с/MS/MS). Здесь мы рассматриваем метаболическую пластичность в рамках теории информации и количественно оцениваем разнообразие и профессионализм метаболома на основе энтропии Шеннона распределения частоты метаболитов. Используя ранее реализованную формулу (8), мы рассчитали набор показателей, которые могут быть использованы для количественной оценки разнообразия метаболома (показатель Hj), специализации метаболического профиля (показатель δj) и метаболической специфичности отдельного метаболита (показатель Si). Кроме того, мы применили индекс относительной пластичности расстояния (RDPI) для количественной оценки индуцируемости метаболома у травоядных (рис. 1А) (30). В рамках этой статистической модели мы рассматриваем спектр MS/MS как основную информационную единицу и обрабатываем относительное количество MS/MS в карту распределения частот, а затем используем энтропию Шеннона для оценки разнообразия метаболома на ее основе. Специализация метаболома измеряется средней специфичностью одного спектра MS/MS. Таким образом, увеличение количества некоторых классов MS/MS после индукции травоядными преобразуется в спектральную индуцируемость, RDPI и специализацию, то есть в увеличение индекса δj, поскольку производится больше специализированных метаболитов и образуется высокий индекс Si. Снижение индекса разнообразия Hj отражает либо уменьшение количества сгенерированных MS/MS, либо изменение распределения частот профиля в менее равномерном направлении, при этом снижая общую неопределенность. С помощью расчета индекса Si можно определить, какие MS/MS-сигналы индуцируются определенными травоядными животными, а какие, наоборот, не реагируют на индукцию, что является ключевым показателем для различения прогнозирования MT и OD.
(A) Статистические дескрипторы, используемые для данных MS/MS, индуцируемых травоядными животными (H1–Hx): индекс индуцируемости (RDPI), разнообразие (индекс Hj), специализация (индекс δj) и специфичность метаболитов (индекс Si). Увеличение степени специализации (δj) указывает на то, что в среднем будет производиться больше специфических для травоядных животных метаболитов, в то время как уменьшение разнообразия (Hj) указывает на уменьшение производства метаболитов или неравномерное распределение метаболитов на карте распределения. Значение Si оценивает, является ли метаболит специфичным для данного условия (здесь, травоядного) или, наоборот, поддерживается на том же уровне. (B) Концептуальная диаграмма предсказания теории защиты с использованием оси теории информации. Теория защиты предсказывает, что атака травоядных животных увеличит количество защитных метаболитов, тем самым увеличивая δj. В то же время Hj уменьшается, поскольку профиль реорганизуется в сторону уменьшения неопределенности метаболической информации. Теория МТ предсказывает, что нападение травоядных животных вызовет ненаправленные изменения в метаболоме, тем самым увеличивая Hj как индикатор повышенной неопределенности метаболической информации и вызывая случайное распределение Si. Мы также предложили смешанную модель, наилучшую МТ, в которой некоторые метаболиты с более высокими защитными значениями будут особенно увеличиваться (высокое значение Si), в то время как другие будут демонстрировать случайные реакции (более низкое значение Si).
Используя дескрипторы теории информации, мы интерпретируем теорию OD, предсказывая, что вызванные травоядными животными изменения специфических метаболитов в неиндуцированном конститутивном состоянии приведут к (i) увеличению метаболической специфичности (индекс Si), определяющей метабономическую специфичность (индекс δj), увеличению определенных групп специфических метаболитов с более высокой защитной ценностью, и (ii) уменьшению разнообразия метаболома (индекс Hj) из-за изменения распределения частоты метаболизма в сторону большего распределения лептиновых тел. На уровне отдельного метаболита ожидается упорядоченное распределение Si, где значение Si метаболита будет увеличиваться в соответствии с его защитной ценностью (рис. 1B). В этом контексте мы объясняем теорию MT, предсказывая, что возбуждение приведет к (i) ненаправленным изменениям метаболитов, приводящим к уменьшению индекса δj, и (ii) увеличению индекса Hj из-за увеличения метаболической неопределенности, или случайности, которую можно количественно оценить с помощью энтропии Шеннона в форме обобщенного разнообразия. Что касается метаболического состава, теория МТ предсказывает случайное распределение Si. Учитывая, что определенные метаболиты в определенных условиях находятся в определенных условиях, а другие — нет, и их защитная ценность зависит от окружающей среды, мы также предложили смешанную защитную модель, в которой δj и Hj распределены по двум направлениям вдоль Si. Увеличение Si происходит во всех направлениях, и только определенные группы метаболитов, обладающие более высокими защитными свойствами, будут особенно увеличивать Si, в то время как другие будут иметь случайное распределение (рис. 1B).
Для проверки предсказания переопределенной теории защиты на основе дескриптора теории информации мы выращивали личинки травоядных насекомых-экспертов (Ms) или генералистов (Sl) на листьях Nepenthes pallens (рис. 2A). Используя MS/MS-анализ, мы получили 599 не избыточных MS/MS-спектров (файл данных S1) из метанольных экстрактов листовой ткани, собранных после питания гусениц. Использование индексов RDPI, Hj и δj для визуализации реконфигурации информационного содержания в файлах конфигурации MS/MS выявляет интересные закономерности (рис. 2B). Общая тенденция такова, что, как описано дескриптором информации, по мере того, как гусеницы продолжают поедать листья, степень всей метаболической реорганизации со временем увеличивается: через 72 часа после поедания травоядными насекомыми RDPI значительно возрастает. По сравнению с неповрежденным контролем, уровень Hj значительно снизился, что объясняется повышенной степенью специализации метаболического профиля, количественно оцененной индексом δj. Эта очевидная тенденция согласуется с предсказаниями теории OD, но противоречит основным предсказаниям теории MT, которая считает, что случайные (ненаправленные) изменения уровней метаболитов используются в качестве защитной маскировки (рис. 1B). Хотя содержание элиситора в ротовой секреции (OS) и пищевое поведение этих двух травоядных различаются, их прямое питание привело к аналогичным изменениям в направлении Hj и δj в течение 24-часового и 72-часового периодов сбора урожая. Единственное различие наблюдалось через 72 часа после прямого питания. По сравнению с метаболизмом, вызванным питанием Ms, общий метаболизм, индуцированный питанием Sl, был выше.
(A) Экспериментальная схема: обыкновенные свиньи (S1) или опытные травоядные животные (Ms) питаются обессоленными листьями кувшинковых растений, а для имитации поедания листьев используется OS Ms (W + OSMs) для обработки ран на стандартизированных участках листа. Личинки S1 (W + OSSl) или вода (W + W). Контроль (C) – неповрежденный лист. (B) Индуцируемость (RDPI по сравнению с контрольной диаграммой), разнообразие (индекс Hj) и индекс специализации (индекс δj), рассчитанные для карты специальных метаболитов (599 MS/MS; файл данных S1). Звездочками отмечены существенные различия между прямым питанием травоядных животных и контрольной группой (критерий Стьюдента с парным t-критерием, *P<0,05 и ***P<0,001). ns – не имеет значения. (C) Индекс временного разрешения спектра основных (синий прямоугольник, аминокислоты, органические кислоты и сахара; файл данных S2) и специальных метаболитов (красный прямоугольник 443 MS/MS; файл данных S1) после имитации обработки травоядными животными. Цветовая полоса соответствует 95% доверительному интервалу. Звездочка указывает на значимую разницу между обработкой и контролем [квадратичный дисперсионный анализ (ANOVA), за которым следует критерий Тьюки для множественных сравнений post hoc, *P<0,05, **P<0,01 и *** P <0,001]. (D) Специализация диаграмм рассеяния и профилей специальных метаболитов (повторные образцы с различными обработками).
Чтобы выяснить, отражается ли вызванная травоядными насекомыми перестройка метаболома на уровне отдельных метаболитов, мы сначала сосредоточились на метаболитах, ранее изученных в листьях Nepenthes pallens с доказанной устойчивостью к травоядным насекомым. Фенольные амиды представляют собой конъюгаты гидроксициннамамида и полиамина, которые накапливаются в процессе поедания насекомыми и, как известно, снижают продуктивность насекомых (32). Мы искали предшественники соответствующих MS/MS и построили их кумулятивные кинетические кривые (рисунок S1). Неудивительно, что производные фенола, которые не участвуют непосредственно в защите от травоядных, такие как хлорогеновая кислота (CGA) и рутин, снижают свою активность после поедания. Напротив, травоядные насекомые могут сделать фенольные амиды очень эффективными. Непрерывное питание двух видов травоядных привело к почти одинаковому спектру возбуждения феноламидов, и эта закономерность была особенно очевидна для синтеза феноламидов de novo. Аналогичное явление будет наблюдаться при исследовании пути 17-гидроксигеранил нонанедиол дитерпеновых гликозидов (17-HGL-DTGs), который производит большое количество ациклических дитерпенов с эффективными антигербиворными функциями (33), причем кормление Ms с Sl вызвало аналогичный профиль экспрессии (Рисунок S1)).
Возможным недостатком экспериментов по прямому кормлению травоядных является разница в скорости потребления листьев и времени кормления травоядных, что затрудняет устранение специфических эффектов, вызванных ранами и травоядными. Чтобы лучше решить проблему видовой специфичности индуцированного метаболического ответа листьев, мы смоделировали кормление личинок Ms и Sl, немедленно нанеся свежесобранные ОС (OSM и OSS1) на стандартный прокол W в одинаковых положениях листа. Эта процедура называется обработкой W + ОС и стандартизирует индукцию, точно определяя время начала реакции, вызываемой травоядными, без влияния различий в скорости или количестве потери ткани (Рисунок 2A) (34). Используя конвейер анализа и вычислений MS/MS, мы получили 443 спектра MS/MS (файл данных S1), которые перекрывались со спектрами, ранее собранными из экспериментов по прямому кормлению. Анализ данных MS/MS с использованием теории информации показал, что перепрограммирование специализированных метаболомов листьев путем имитации воздействия травоядных животных продемонстрировало специфические для OS стимулы (рис. 2C). В частности, по сравнению с обработкой OSS1, OSM вызвал усиление специализации метаболома через 4 часа. Стоит отметить, что по сравнению с экспериментальными данными прямого кормления травоядных животных, метаболическая кинетика, визуализированная в двухмерном пространстве с использованием Hj и δj в качестве координат, и направленность специализации метаболома в ответ на имитацию воздействия травоядных животных с течением времени демонстрируют последовательное увеличение (рис. 2D). В то же время мы количественно оценили содержание аминокислот, органических кислот и сахаров (файл данных S2), чтобы исследовать, связано ли это целенаправленное увеличение специализации метаболома с перестройкой центрального углеродного метаболизма в ответ на имитацию воздействия травоядных животных (рис. S2). Для лучшего объяснения этой закономерности мы дополнительно проанализировали кинетику накопления метаболитов ранее обсуждавшихся путей феноламида и 17-HGL-DTG. Специфическая для OS индукция у травоядных животных трансформируется в дифференциальную перестройку в метаболизме феноламида (рис. S3). Фенольные амиды, содержащие кумариновые и кофеоильные фрагменты, преимущественно индуцируются OSS1, в то время как OSM вызывают специфическую индукцию ферулильных конъюгатов. Для пути 17-HGL-DTG была обнаружена дифференциальная индукция OS продуктами последующего малонилирования и дималонилирования (рис. S3).
Далее мы изучили индуцированную ОС пластичность транскриптома, используя набор данных микроматриц временного ряда, который имитирует использование ОСМ для обработки листьев розеточных растений травоядными животными. Кинетика отбора проб в основном совпадает с кинетикой, использованной в этом метаболомном исследовании (35). По сравнению с реконфигурацией метаболома, при которой метаболическая пластичность особенно увеличивается со временем, мы наблюдаем транзиторные всплески транскрипции в листьях, индуцированные Мс, где индуцируемость транскриптома (RDPI) и специализация (δj) находятся на уровне 1. Наблюдалось значительное увеличение количества часов, а разнообразие (Hj) в этот момент времени значительно снизилось, после чего произошло ослабление специализации транскриптома (рисунок S4). Семейства метаболических генов (таких как P450, гликозилтрансфераза и BAHD-ацилтрансфераза) участвуют в процессе сборки специальных метаболитов из структурных единиц, полученных из первичного метаболизма, следуя вышеупомянутой модели ранней высокой специализации. В качестве примера был проанализирован фенилаланиновый путь. Анализ подтвердил, что основные гены метаболизма феноламида сильно индуцируются ОС у травоядных животных по сравнению с непривлекаемыми растениями и тесно связаны по своим паттернам экспрессии. Транскрипционный фактор MYB8 и структурные гены PAL1, PAL2, C4H и 4CL, расположенные выше по этому пути, показали раннюю инициацию транскрипции. Ацилтрансферазы, играющие роль в окончательной сборке феноламида, такие как AT1, DH29 и CV86, демонстрируют длительную активацию (рисунок S4). Вышеизложенные наблюдения указывают на то, что ранняя инициация специализации транскриптома и последующее усиление специализации метаболомики представляют собой взаимосвязанный механизм, который может быть обусловлен синхронной регуляторной системой, инициирующей мощную защитную реакцию.
Перестройка в системе сигнализации растительных гормонов действует как регуляторный слой, интегрирующий информацию от травоядных животных для перепрограммирования физиологии растений. После моделирования воздействия травоядных животных мы измерили кумулятивную динамику ключевых категорий растительных гормонов и визуализировали временную коэкспрессию между ними [коэффициент корреляции Пирсона (PCC) > 0,4] (Рисунок 3А). Как и ожидалось, растительные гормоны, связанные с биосинтезом, связаны внутри сети коэкспрессии растительных гормонов. Кроме того, метаболическая специфичность (индекс Si) нанесена на эту сеть, чтобы выделить растительные гормоны, индуцированные различными воздействиями. Выделены две основные области специфической реакции на воздействие травоядных животных: одна находится в кластере JA, где JA (ее биологически активная форма JA-Ile) и другие производные JA показывают самый высокий показатель Si; другая — этилен (ET). Гиббереллин показал лишь умеренное увеличение специфичности к травоядным животным, в то время как другие растительные гормоны, такие как цитокинин, ауксин и абсцизовая кислота, имели низкую специфичность индукции для травоядных. По сравнению с использованием только W + W, усиление пикового значения производных JA за счет применения OS (W + OS) в основном может быть преобразовано в сильный специфический индикатор JA. Неожиданно, известно, что OSM и OSS1 с различным содержанием элиситора вызывают аналогичное накопление JA и JA-Ile. В отличие от OSS1, OSM специфически и сильно индуцируется OSM, в то время как OSS1 не усиливает реакцию базальных ран (рисунок 3B).
(A) Анализ сети совместной экспрессии на основе расчета PCC моделирования кинетики накопления растительных гормонов, вызванного травоядными насекомыми. Узел представляет собой отдельный растительный гормон, а размер узла отражает индекс Si, специфичный для данного растительного гормона в разных вариантах обработки. (B) Накопление JA, JA-Ile и ET в листьях, вызванное различными вариантами обработки, обозначенными разными цветами: абрикосовый, W + OSM; синий, W + OSSl; черный, W + W; серый, C (контроль). Звездочками отмечены значимые различия между вариантом обработки и контролем (двухфакторный дисперсионный анализ с последующим апостериорным множественным сравнением Тьюки HSD, *** P <0,001). Анализ с использованием теории информации (C)697 MS/MS (файл данных S1) в биосинтезе JA и нарушенном спектре восприятия (irAOC и irCOI1) и (D)585 MS/MS (файл данных S1) в ETR1 с нарушенным сигналом ET. Два варианта обработки имитирующими травоядными насекомыми активировали линии растений и контрольные растения с пустым транспортным средством (EV). Звездочками отмечены значимые различия между обработкой W+OS и неповрежденным контролем (двухфакторный дисперсионный анализ с последующим апостериорным множественным сравнением Тьюки HSD, *P<0,05, **P<0,01 и ***P<0,001). (E) Диаграммы рассеяния, демонстрирующие противодействие специализации. Цвета представляют различные генетически модифицированные штаммы; символы представляют различные методы обработки: треугольник, W + OSS1; прямоугольник, W + OSM; круг C
Далее мы используем генетически модифицированный штамм ослабленного непентеса (irCOI1 и sETR1) на ключевых этапах биосинтеза JA и ET (irAOC и irACO) и их восприятия (irCOI1 и sETR1) для анализа метаболизма этих двух растительных гормонов у травоядных животных и относительного вклада перепрограммирования. В соответствии с предыдущими экспериментами, мы подтвердили индукцию окислительного стресса у травоядных животных в растениях с пустым носителем (EV) (рис. 3, C-D) и общее снижение индекса Hj, вызванное OSM, в то время как индекс δj увеличился. Реакция более выражена, чем реакция, вызванная OSS1. Двухлинейный график, использующий Hj и δj в качестве координат, показывает специфическую дерегуляцию (рис. 3E). Наиболее очевидная тенденция заключается в том, что в штаммах, лишенных сигнала JA, разнообразие метаболома и изменения специализации, вызванные травоядными животными, практически полностью устраняются (рис. 3C). Напротив, молчаливое восприятие ЭТ у растений sETR1, хотя общий эффект на изменения метаболизма травоядных животных значительно ниже, чем у сигнализации JA, ослабляет разницу в индексах Hj и δj между возбуждениями OSM и OSS1 (рис. 3D и рис. S5). Это указывает на то, что помимо основной функции передачи сигнала JA, передача сигнала ЭТ также служит тонкой настройкой видоспецифического метаболического ответа травоядных животных. В соответствии с этой функцией тонкой настройки, не наблюдалось изменений в общей индуцируемости метаболома у растений sETR1. С другой стороны, по сравнению с растениями sETR1, растения irACO индуцировали аналогичные общие амплитуды метаболических изменений, вызванных травоядными животными, но показали значительно различающиеся значения Hj и δj между воздействиями OSM и OSS1 (рис. S5).
Для идентификации специализированных метаболитов, вносящих важный вклад в видоспецифическую реакцию травоядных животных, и точной настройки их продукции с помощью сигналов ЭТ, мы использовали ранее разработанный структурный метод MS/MS. Этот метод основан на методе бикластеризации для повторного определения метаболического семейства по фрагментам MS/MS [нормализованное скалярное произведение (NDP)] и показателю сходства, основанному на нейтральной потере (NL). Набор данных MS/MS, построенный на основе анализа трансгенных линий ЭТ, содержал 585 MS/MS (файл данных S1), которые были разделены на семь основных модулей MS/MS (M) (рисунок 4A). Некоторые из этих модулей плотно упакованы ранее охарактеризованными специальными метаболитами: например, M1, M2, M3, M4 и M7 богаты различными производными фенола (M1), флавоноидными гликозидами (M2), ациловыми сахарами (M3 и M4) и 17-HGL-DTG (M7). Кроме того, рассчитывается метаболическая специфичность (индекс Si) отдельного метаболита в каждом модуле, и его распределение Si можно наглядно увидеть. Вкратце, спектры MS/MS, демонстрирующие высокую специфичность к поеданию травоядными животными и генотипу, характеризуются высокими значениями Si, а статистика эксцесса указывает на распределение шерсти в правом углу хвоста. Одно из таких распределений худого коллоида было обнаружено в M1, где феноламид показал самую высокую фракцию Si (рис. 4B). Упомянутый ранее индуцируемый травоядными животными 17-HGL-DTG в M7 показал умеренный показатель Si, указывающий на умеренную степень дифференциальной регуляции между двумя типами ОС. В отличие от этого, большинство конститутивно продуцируемых специализированных метаболитов, таких как рутин, CGA и ацилсахара, имеют самые низкие показатели Si. Для лучшего изучения структурной сложности и распределения Si между специальными метаболитами для каждого модуля была построена молекулярная сеть (рис. 4B). Важное предсказание теории OD (суммированное на рисунке 1B) заключается в том, что реорганизация специальных метаболитов после поедания травоядными должна приводить к односторонним изменениям метаболитов с высокой защитной ценностью, особенно за счет повышения их специфичности (в отличие от случайного распределения). Модуля) Защитный метаболит, предсказанный теорией MT. Большинство производных фенола, накопленных в M1, функционально связаны со снижением продуктивности насекомых (32). При сравнении значений Si в метаболитах M1 между индуцированными листьями и составляющими листьями контрольных растений EV через 24 часа мы наблюдали, что метаболическая специфичность многих метаболитов после поедания травоядными насекомыми имеет значительную тенденцию к увеличению (рисунок 4C). Специфическое увеличение значения Si было обнаружено только в защитных феноламидах, но увеличения значения Si не было обнаружено в других фенолах и неизвестных метаболитах, сосуществующих в этом модуле. Это специализированная модель, которая связана с теорией OD. Основные предсказания метаболических изменений, вызванных травоядными насекомыми, согласуются. Чтобы проверить, была ли эта особенность спектра феноламида вызвана специфическим для ОС ET, мы построили график индекса Si метаболита и выявили дифференциальное значение экспрессии между OSM и OSS1 в генотипах EV и sETR1 (рисунок 4D). В sETR1 разница между OSM и OSS1, вызванная феноламидом, была значительно уменьшена. Метод бикластеризации также был применен к данным MS/MS, собранным в штаммах с недостаточным содержанием JA, для определения основных модулей MS/MS, связанных с регулируемой JA метаболической специализацией (рисунок S6).
(A) Результаты кластеризации 585 MS/MS на основе общего фрагмента (сходство NDP) и общей нейтральной потери (сходство NL) показывают, что модуль (M) соответствует известному семейству соединений или неизвестному или слабо метаболизируемому составу метаболита. Рядом с каждым модулем показано распределение специфичности метаболита (MS/MS) (Si). (B) Модульная молекулярная сеть: узлы представляют MS/MS, а ребра — значения MS/MS NDP (красный) и NL (синий) (пороговое значение > 0,6). Градуированный индекс специфичности метаболита (Si) окрашен в соответствии с модулем (слева) и отображен на молекулярной сети (справа). (C) Модуль M1 растения EV в конститутивном (контрольном) и индуцированном состоянии (имитация травоядного) через 24 часа: диаграмма молекулярной сети (значение Si — размер узла, защитный феноламид выделен синим цветом). (D) Молекулярная сетевая диаграмма M1 спектральной линии sETR1 с нарушенным восприятием EV и ET: фенольное соединение, представленное зеленым кругом-узлом, и значимая разница (значение P) между обработками W + OSM и W + OSS1 в виде размера узла. CP, N-кофеоил-тирозин; CS, N-кофеоил-спермидин; FP, N-феруловая кислота эфир мочевой кислоты; FS, N-ферулил-спермидин; CoP, N', N'-кумаролил-тирозин; DCS, N', N'-дикофеоил-спермидин; CFS, N', N'-кофеоил-ферулоил-спермидин; Lycium barbarum в ягодах годжи Son; Nick. O-AS, O-ациловый сахар.
Мы дополнительно расширили анализ от одного ослабленного генотипа Nepenthes до природных популяций, где ранее в природных популяциях были описаны сильные внутривидовые изменения уровней JA и уровней специфических метаболитов у травоядных животных (26). Используя этот набор данных, мы охватили 43 генотипа. Эти генотипы состоят из 123 видов растений N. pallens. Эти растения были получены из семян, собранных в различных естественных местообитаниях в Юте, Неваде, Аризоне и Калифорнии (Рисунок S7). Мы рассчитали разнообразие метаболома (здесь называемое популяционным уровнем) β-разнообразие) и специализацию, вызванную OSM. В соответствии с предыдущими исследованиями, мы наблюдали широкий спектр метаболических изменений вдоль осей Hj и δj, что указывает на то, что генотипы имеют значительные различия в пластичности своих метаболических реакций на травоядных животных (Рисунок S7). Эта организация напоминает предыдущие наблюдения о динамическом диапазоне изменений JA, вызванных травоядными животными, и сохраняет очень высокое значение в одной популяции (26, 36). Используя JA и JA-Ile для проверки общей корреляции уровней между Hj и δj, мы обнаружили значительную положительную корреляцию между JA и индексом β-разнообразия и специализации метаболома (рисунок S7). Это предполагает, что гетерогенность индукции JA, вызванная травоядными животными и обнаруженная на популяционном уровне, может быть обусловлена ​​ключевыми метаболическими полиморфизмами, вызванными отбором со стороны насекомых-травоядных.
Предыдущие исследования показали, что типы табака значительно различаются по типу и относительной зависимости от индуцированной и конститутивной метаболической защиты. Считается, что эти изменения в передаче сигналов против травоядных и защитных способностях регулируются давлением популяции насекомых, жизненным циклом растения и затратами на производство защиты в нише, где произрастает данный вид. Мы изучили согласованность ремоделирования метаболома листьев, индуцированного травоядными, шести видов Nicotiana, произрастающих в Северной и Южной Америке. Эти виды тесно связаны с Nepenthes North America, а именно Nicolas Bociflo. La, N. nicotinis, Nicotiana n. attenuated grass, Nicotiana tabacum, linear tobacco, tobacco (Nicotiana spegazzinii) и tobacco leaf tobacco (Nicotiana obtusifolia) (Рисунок 5A) (37). Шесть из этих видов, включая хорошо изученный вид N. please, являются однолетними растениями клады петуний, а obtusifolia N. – многолетними растениями сестринской клады Trigonophyllae (38). Впоследствии на этих семи видах была проведена индукция W + W, W + OSM и W + OSS1 для изучения метаболической перестройки на видовом уровне при питании насекомых.
(A) Филогенетическое дерево, построенное методом бутстрапа на основе максимального правдоподобия [для ядерного синтеза глутамина (38)] и географического распределения семи близкородственных видов Nicotiana (разные цвета) (37). (B) Диаграмма рассеяния специализированного разнообразия метаболических профилей семи видов Nicotiana (939 MS/MS; файл данных S1). На видовом уровне разнообразие метаболома отрицательно коррелирует со степенью специализации. Анализ корреляции на видовом уровне между метаболическим разнообразием и специализацией, а также накоплением JA показан на рисунке 2. S9. Цвет, разные типы; треугольник, W + OSS1; прямоугольник, W + OSM; (C) Динамика JA и JA-Ile в Nicotiana ранжирована в соответствии с амплитудой возбуждения OS (двухфакторный дисперсионный анализ и множественное сравнение по Тьюки HSD, * P <0,05, ** P <0,01 и * ** Для сравнения W + OS и W + W, P <0,001). Диаграмма размаха (D) разнообразия и (E) специализации каждого вида после моделирования травоядности и воздействия метилжасмоновой кислоты (MeJA). Звездочкой отмечена существенная разница между группами W + OS и W + W или ланолином плюс W (Lan + W) или Lan плюс MeJA (Lan + MeJa) и контрольной группой Lan (двухфакторный дисперсионный анализ с последующим апостериорным множественным сравнением по Тьюки HSD, *P<0,05, **P<0,01 и ***P<0,001).
Используя метод двойной кластеризации, мы идентифицировали 9 модулей из 939 MS/MS (файл данных S1). Состав MS/MS, реконфигурированный различными обработками, значительно различается между модулями у разных видов (рисунок S8). Визуализация Hj (здесь называемого γ-разнообразием на уровне видов) и δj показывает, что разные виды объединяются в очень разные группы в метаболическом пространстве, где разделение на уровне видов обычно более выражено, чем возбуждение. За исключением N. linear и N. obliquus, они демонстрируют широкий динамический диапазон эффектов индукции (рисунок 5B). В отличие от них, такие виды, как N. purpurea и N. obtusifolia, имеют менее выраженный метаболический ответ на обработку, но их метаболом более разнообразен. Видоспецифическое распределение индуцированного метаболического ответа привело к значительной отрицательной корреляции между специализацией и гамма-разнообразием (PCC = -0,46, P = 4,9×10⁻⁸). Изменения уровней жасмоновой кислоты (ЖК), вызванные окислительным стрессом (ОС), положительно коррелируют со специализацией метаболома и отрицательно коррелируют с разнообразием метаболической гамма-активности, проявляемым каждым видом (рисунок 5B и рисунок S9). Стоит отметить, что виды, которые в просторечии называют видами «сигнального ответа» на рисунке 5C, такие как нематоды Nepenthes, Nepenthes nepenthes, Nepenthes acute и Nepenthes attenuated, вызывали значительные признаки через 30 минут. Недавние вспышки ОС-специфических реакций на ЖК и ЖК-Ile, в то время как другие бактерии, называемые «сигнально-нечувствительными», такие как Nepenthes mills, Nepenthes powdery и N. obtusifolia, демонстрируют только индукцию JA-Ile Edge без какой-либо ОС-специфичности (рисунок 5C). На метаболическом уровне, как упоминалось выше, для ослабленных непентесов вещества, реагирующие на сигнал, показали ОС-специфичность и значительно увеличили δj, одновременно снизив Hj. Этот специфический для ОС эффект прайминга не был обнаружен у видов, классифицированных как не реагирующие на сигналы (рис. 5, D и E). Специфические для ОС метаболиты чаще встречаются у видов, реагирующих на сигналы, и эти кластеры сигналов группируются с видами со слабой реакцией на сигналы, в то время как виды со слабой реакцией на сигналы демонстрируют меньшую взаимозависимость (рис. S8). Этот результат указывает на то, что специфическая для ОС индукция JA и специфическая для ОС реконфигурация нижележащего метаболома связаны на видовом уровне.
Далее мы использовали ланолиновую пасту, содержащую метил-ЖК (MeJA), для обработки растений, чтобы исследовать, ограничиваются ли эти режимы связи доступностью ЖК, применяемой экзогенно, которая будет находиться в цитоплазме растений. Быстрая деэтерификация — это ЖК. Мы обнаружили ту же тенденцию постепенного изменения от видов, реагирующих на сигнал, к видам, не реагирующим на сигнал, вызванную непрерывным поступлением ЖК (рисунок 5, D и E). Вкратце, обработка MeJA сильно перепрограммировала метаболомы линейных нематод N. obliquus, N. aquaticus, N. pallens и N. mikimotoi, что привело к значительному увеличению δj и уменьшению Hj. У N. purpurea наблюдалось только увеличение δj, но не Hj. N. obtusifolia, которая, как было показано ранее, накапливает крайне низкие уровни ЖК, также плохо реагирует на обработку MeJA с точки зрения реконфигурации метаболома. Эти результаты указывают на то, что производство JA или передача сигнала физиологически ограничены у видов, не реагирующих на сигнал. Чтобы проверить эту гипотезу, мы изучили четыре вида (N. pallens, N. mills, N. pink и N. microphylla), индуцированные транскриптомом W + W, W + OSMs и W + OSS1 (39). В соответствии с характером ремоделирования метаболома, виды хорошо разделены в пространстве транскриптома, среди которых N. attenuated показал самый высокий RDPI, индуцированный OS, в то время как N. gracilis — самый низкий (Рисунок 6A). Однако было обнаружено, что разнообразие транскриптома, индуцированное N. oblonga, было самым низким среди четырех видов, в отличие от самого высокого метабономического разнообразия N. oblonga, ранее показанного у семи видов. Предыдущие исследования показали, что набор генов, связанных с ранними защитными сигналами, включая сигналы JA, объясняет специфичность ранних защитных реакций, индуцированных элиситорами, связанными с травоядными животными, у видов Nicotiana (39). Сравнение сигнальных путей JA у этих четырех видов выявило интересную закономерность (рисунок 6B). Большинство генов в этом пути, таких как AOC, OPR3, ACX и COI1, показали относительно высокий уровень индукции у этих четырех видов. Однако ключевой ген, JAR4, преобразует JA в его биологически активную форму JA-Ile, накапливая транскрипты, и уровень его транскрипции очень низок, особенно у N. mills, Nepenthes pieris и N. microphylla. Кроме того, транскрипт другого гена, AOS, не был обнаружен у N. bifidum. Эти изменения в экспрессии генов могут быть причиной экстремальных фенотипов, вызванных низким уровнем продукции JA у видов с анергией сигнальных путей и индукцией у N. gracilis.
(A) Анализ теории информации перепрограммирования ранних транскрипционных ответов четырех близкородственных видов табака, отобранных через 30 минут после индукции травоядными насекомыми. RDPI рассчитывается путем сравнения листьев, обработанных травоядными насекомыми OS, с контрольными листьями после повреждения. Цвета обозначают разные виды, а символы — разные методы обработки. (B) Анализ экспрессии генов в сигнальных путях JA среди четырех видов. Упрощенный путь JA показан рядом с диаграммой размаха. Разные цвета обозначают разные методы обработки. Звездочка указывает на значительную разницу между обработкой W + OS и контролем W + W (для t-критерия Стьюдента для попарных различий, *P<0,05, **P<0,01 и ***P<0,001). OPDA, 12-оксофитодиеновая кислота; OPC-8: 0,3-оксо-2(2′(Z)-пентенил)-циклопентан-1-октановая кислота.
В последней части мы изучали, как видоспецифическая перестройка метаболома различных видов растений, вызываемых насекомыми, может быть устойчива к травоядным. Предыдущие исследования были сосредоточены на роде Nicotiana. Их устойчивость к Ms и личинкам значительно различается (40). Здесь мы изучили связь между этой моделью и их метаболической пластичностью. Используя вышеупомянутые четыре вида табака и проверяя корреляцию между разнообразием и специализацией метаболома, вызванными травоядными, и устойчивостью растений к Ms и Sl, мы обнаружили, что устойчивость, разнообразие и специализация к генералисту Sl положительно коррелируют, в то время как корреляция между устойчивостью к экспертам и специализацией слабая, а корреляция с разнообразием незначительна (Рисунок S10). Что касается устойчивости к S1, то как ослабленные N. chinensis, так и N. gracilis, которые, как было показано ранее, демонстрируют как уровни передачи сигнала JA, так и пластичность метаболома, имели значительно различающиеся реакции на воздействие травоядных, и они также показали схожую высокую устойчивость. Пол.
За последние шестьдесят лет теория защиты растений предоставила теоретическую основу, на которой исследователи предсказали значительное количество эволюции и функций специализированных метаболитов растений. Большинство этих теорий не следуют обычной процедуре сильных выводов (41). Они предлагают ключевые предсказания (3) на одном и том же уровне анализа. Когда проверка ключевых предсказаний позволяет анализировать конкретные теории, это позволит поддержать теорию и отвергнуть другие (42). Вместо этого новая теория делает предсказания на разных уровнях анализа и добавляет новый слой описательных соображений (42). Однако две теории, предложенные на функциональном уровне, MT и OD, легко объясняются как важные предсказания специализированных метаболических изменений, вызванных травоядными животными: теория OD считает, что изменения в специализированном метаболическом «пространстве» носят высоконаправленный характер. Теория MT считает, что эти изменения будут ненаправленными и случайным образом расположены в метаболическом пространстве и, как правило, связаны с метаболитами, имеющими высокую защитную ценность. Предыдущие исследования прогнозов OD и MT проводились с использованием узкого набора априорных «защитных» соединений. Эти метаболит-центрированные тесты исключают возможность анализа масштаба и траектории реконфигурации метаболома во время поедания травоядными животными и не позволяют проводить тестирование в рамках последовательной статистической структуры, требующей ключевых прогнозов, которые можно рассматривать в целом. Количественная оценка изменений в метаболоме растений. Здесь мы использовали инновационную технологию в метаболомике, основанную на вычислительной масс-спектрометрии, и провели деконволюционный масс-спектрометрический анализ в общем контексте дескрипторов теории информации, чтобы проверить различие между двумя предложенными на глобальном уровне метаболомики. Ключевое предсказание этой теории. Теория информации применялась во многих областях, особенно в контексте исследований биоразнообразия и потока питательных веществ (43). Однако, насколько нам известно, это первое применение, используемое для описания метаболического информационного пространства растений и решения экологических проблем, связанных с временными метаболическими изменениями в ответ на сигналы окружающей среды. В частности, возможности этого метода заключаются в его способности сравнивать закономерности внутри и между видами растений, чтобы изучить, как травоядные животные эволюционировали от разных видов к межвидовым макроэволюционным закономерностям на разных уровнях эволюции. Метаболизм.
Метод анализа главных компонентов (PCA) преобразует многомерный набор данных в пространство уменьшения размерности, что позволяет объяснить основные тенденции данных. Поэтому он обычно используется в качестве исследовательского метода для анализа набора данных, например, для деконволюции метаболома. Однако уменьшение размерности приводит к потере части информационного содержания набора данных, и PCA не может предоставить количественную информацию о характеристиках, особенно важных для экологической теории, таких как: как травоядные животные перестраивают разнообразие в специализированных областях (например, видовое богатство, распределение и численность) метаболитов? Какие метаболиты являются предикторами индуцированного состояния данного травоядного животного? С точки зрения специфичности, разнообразия и индуцируемости, информационное содержание профиля метаболитов, специфичного для листьев, разлагается, и обнаруживается, что поедание травоядными животными может активировать специфический метаболизм. Неожиданно мы обнаружили, что, как описано в реализованных индикаторах теории информации, результирующая метаболическая ситуация имеет большое совпадение после атак двух травоядных (ночного питающегося генералиста Sl) и эксперта по пасленовым Ms. Хотя их пищевое поведение и концентрация значительно различаются. Инициатор конъюгата жирной кислоты и аминокислоты (FAC) в OS (31). При использовании OS травоядных для обработки стандартизированных колотых ран, имитация обработки травоядными также показала аналогичную тенденцию. Эта стандартизированная процедура моделирования реакции растений на атаки травоядных устраняет мешающие факторы, вызванные изменениями в пищевом поведении травоядных, которые приводят к различной степени повреждения в разное время (34). FAC, который, как известно, является основной причиной OSM, снижает JAS и другие реакции растительных гормонов в OSS1, в то время как OSS1 снижает их в сотни раз (31). Однако OSS1 вызвал аналогичные уровни накопления JA по сравнению с OSM. Ранее было показано, что реакция JA у ослабленных Nepenthes очень чувствительна к OSM, где FAC может сохранять свою активность даже при разведении в соотношении 1:1000 водой (44). Поэтому, по сравнению с OSM, хотя FAC в OSS1 очень низкий, его достаточно для того, чтобы вызвать достаточное всплеск JA. Предыдущие исследования показали, что порин-подобные белки (45) и олигосахариды (46) могут использоваться в качестве молекулярных сигналов для запуска защитных реакций растений в OSS1. Однако до сих пор неясно, ответственны ли эти элиситоры в OSS1 за накопление JA, наблюдаемое в данном исследовании.
Хотя существует немного исследований, описывающих дифференциальные метаболические профили, вызванные применением различных травоядных животных или экзогенной JA или SA (салициловой кислоты) (47), никто не изучал видоспецифические нарушения в сети метаболизма травоядных животных и их влияние на специфическую личную информацию. Этот анализ дополнительно подтвердил, что связь внутренней гормональной сети с другими растительными гормонами, помимо JA, формирует специфичность метаболической реорганизации, вызванной травоядными животными. В частности, мы обнаружили, что ET, вызванный OSM, был значительно больше, чем вызванный OSS1. Этот режим согласуется с более высоким содержанием FAC в OSM, что является необходимым и достаточным условием для запуска всплеска ET (48). В контексте взаимодействия между растениями и травоядными животными сигнальная функция ET на динамику метаболитов, специфичную для растений, все еще спорадична и нацелена только на одну группу соединений. Кроме того, в большинстве исследований для изучения регуляции ЭТ использовалось экзогенное применение ЭТ или его предшественников, а также различных ингибиторов, при этом эти экзогенные химические применения вызывают множество неспецифических побочных эффектов. Насколько нам известно, данное исследование представляет собой первое крупномасштабное систематическое изучение роли ЭТ в использовании ЭТ для получения и восприятия нарушенных трансгенных растений с целью координации динамики метаболома растений. Специфическая для травоядных животных индукция ЭТ может в конечном итоге модулировать метаболомный ответ. Наиболее значимым является трансгенная манипуляция генами биосинтеза (ACO) и восприятия (ETR1) ЭТ, которая выявила специфичное для травоядных животных накопление феноламидов de novo. Ранее было показано, что ЭТ может точно регулировать накопление никотина, индуцированное ЖА, путем регулирования N-метилтрансферазы путресцина (49). Однако с механической точки зрения неясно, как ЭТ точно регулирует индукцию фенамида. Помимо функции передачи сигнала ET, метаболический поток также может быть перенаправлен на S-аденозил-1-метионин для регулирования затрат на полиаминофеноламиды. S-аденозил-1-метионин является ET и общим промежуточным продуктом пути биосинтеза полиаминов. Механизм, посредством которого сигнал ET регулирует уровень феноламида, требует дальнейшего изучения.
Долгое время, из-за большого количества специфических метаболитов с неизвестной структурой, пристальное внимание к конкретным метаболическим категориям не позволяло строго оценить временные изменения метаболического разнообразия после биологических взаимодействий. В настоящее время, на основе анализа теории информации, основной результат получения MS/MS-спектров на основе непредвзятых метаболитов показывает, что травоядные животные, питающиеся травоядными или имитирующие их, продолжают снижать общее метаболическое разнообразие метаболома листьев, одновременно увеличивая степень его специализации. Это временное увеличение специфичности метаболома, вызванное травоядными животными, связано с синергетическим увеличением специфичности транскриптома. Особенностью, в наибольшей степени способствующей этой большей специализации метаболома (имеющей более высокое значение Si), является специфический метаболит с ранее охарактеризованной функцией травоядных животных. Эта модель согласуется с предсказаниями теории OD, но предсказания теории MT, связанные со случайностью перепрограммирования метаболома, не согласуются. Однако эти данные также согласуются с предсказаниями смешанной модели (наилучший MT; рисунок 1B), поскольку другие нехарактеризованные метаболиты с неизвестными защитными функциями могут по-прежнему следовать случайному распределению Si.
Примечательная закономерность, выявленная в ходе этого исследования, заключается в том, что от уровня микроэволюции (отдельное растение и популяция табака) до более крупного эволюционного масштаба (близкородственные виды табака) разные уровни эволюционной организации находятся в «наилучшей защите». Существуют значительные различия в способностях травоядных животных. Мур и др. (20) и Кесслер и Кальске (1) независимо друг от друга предложили преобразовать три функциональных уровня биоразнообразия, первоначально выделенных Уиттакером (50), в конститутивные и индуцированные временные изменения химического разнообразия; эти авторы не обобщили процедуры сбора данных метаболома в больших масштабах, а также не описали, как рассчитать метаболическое разнообразие на основе этих данных. В данном исследовании незначительные корректировки функциональной классификации Уиттакера будут рассматривать α-метаболическое разнообразие как разнообразие спектров MS/MS в данном растении, β-метаболическое разнообразие как основной внутривидовой метаболизм группы популяций, а γ-метаболическое разнообразие будет расширением анализа сходных видов.
Сигнал JA имеет важное значение для широкого спектра метаболических реакций травоядных животных. Однако отсутствует строгая количественная проверка вклада внутривидовой регуляции биосинтеза JA в разнообразие метаболома, и вопрос о том, является ли сигнал JA общим местом для стресс-индуцированной метаболической диверсификации в более высоком макроэволюционном масштабе, остается неясным. Мы наблюдали, что травоядная природа Nepenthes вызывает специализацию метаболома, и вариации специализации метаболома внутри популяции видов Nicotiana и среди близкородственных видов Nicotiana систематически положительно коррелируют с сигнализацией JA. Кроме того, при нарушении сигнала JA метаболическая специфичность, индуцированная травоядным животным одного генотипа, будет нивелирована (рис. 3, C и E). Поскольку изменения метаболического спектра естественно ослабленных популяций Nepenthes в основном носят количественный характер, изменения метаболического β-разнообразия и специфичности в этом анализе могут быть в значительной степени вызваны сильным возбуждением категорий соединений, богатых метаболитами. Эти классы соединений доминируют в части метаболомного профиля и приводят к положительной корреляции с сигналами жасмоновой кислоты.
Поскольку биохимические механизмы близкородственных видов табака сильно различаются, метаболиты идентифицируются качественно, что делает процесс более аналитическим. Обработка полученного метаболического профиля с помощью теории информации показывает, что индукция со стороны травоядных животных усугубляет компромисс между разнообразием метаболической гамма-гаммы и специализацией. Сигнал жасмоновой кислоты (ЖК) играет центральную роль в этом компромиссе. Увеличение специализации метаболома согласуется с основным предсказанием оптической плотности (ОП) и положительно коррелирует с сигналом ЖК, в то время как сигнал ЖК отрицательно коррелирует с разнообразием метаболической гамма-гаммы. Эти модели показывают, что способность растений к ОП в основном определяется пластичностью ЖК, как на микроэволюционном, так и на более крупном эволюционном уровне. Эксперименты по экзогенному применению ЖК, которые обходят дефекты биосинтеза ЖК, дополнительно показывают, что близкородственные виды табака можно разделить на виды, реагирующие на сигнал, и виды, не реагирующие на сигнал, подобно тому, как изменяется их режим ЖК и пластичность метаболома под воздействием травоядных животных. Виды, не реагирующие на сигналы, не могут реагировать из-за неспособности производить эндогенную жасмоновую кислоту и, следовательно, подвержены физиологическим ограничениям. Это может быть вызвано мутациями в некоторых ключевых генах сигнального пути жасмоновой кислоты (AOS и JAR4 у N. crescens). Этот результат подчеркивает, что эти межвидовые макроэволюционные закономерности могут быть в основном обусловлены изменениями во внутреннем восприятии гормонов и чувствительности к ним.
Помимо взаимодействия растений и травоядных животных, исследование метаболического разнообразия связано со всеми важными теоретическими достижениями в изучении биологической адаптации к окружающей среде и эволюции сложных фенотипических признаков. С увеличением объема данных, получаемых современными масс-спектрометрами, проверка гипотез о метаболическом разнообразии теперь может выходить за рамки индивидуальных/категорийных различий метаболитов и проводить глобальный анализ для выявления неожиданных закономерностей. В процессе крупномасштабного анализа важной метафорой является идея создания осмысленных карт, которые можно использовать для исследования данных. Поэтому важным результатом современного сочетания непредвзятой метаболомики MS/MS и теории информации является предоставление простой метрики, которую можно использовать для построения карт, позволяющих изучать метаболическое разнообразие в различных таксономических масштабах. Это основное требование данного метода. Изучение микро/макроэволюции и экологии сообществ.
На макроэволюционном уровне ядро ​​теории коэволюции растений и насекомых Эрлиха и Равена (51) состоит в том, чтобы предсказать, что вариативность межвидового метаболического разнообразия является причиной диверсификации линий растений. Однако за пятьдесят лет, прошедших с момента публикации этой основополагающей работы, эта гипотеза редко проверялась (52). Это во многом связано с филогенетическими характеристиками сопоставимых метаболических свойств в отдаленных линиях растений. Редкость может быть использована для привязки целевых методов анализа. Современный рабочий процесс MS/MS, обрабатываемый с помощью теории информации, количественно оценивает структурное сходство MS/MS неизвестных метаболитов (без предварительного отбора метаболитов) и преобразует эти MS/MS в набор MS/MS, таким образом, в профессиональном метаболизме эти макроэволюционные модели сравниваются в классификационной шкале. Простые статистические показатели. Процесс аналогичен филогенетическому анализу, который может использовать выравнивание последовательностей для количественной оценки скорости диверсификации или эволюции признаков без предварительного прогнозирования.
На биохимическом уровне гипотеза скрининга Фирна и Джонса (53) показывает, что метаболическое разнообразие поддерживается на разных уровнях для обеспечения сырья для проявления биологической активности ранее не связанных или замещенных метаболитов. Методы теории информации предоставляют основу, в рамках которой эти специфические для метаболитов эволюционные переходы, происходящие во время специализации метаболитов, могут быть количественно оценены как часть предлагаемого процесса эволюционного скрининга: биологически активная адаптация от низкоспецифичных к высокоспецифичным ингибированным метаболитам данной среды.
В целом, на заре молекулярной биологии были разработаны важные теории защиты растений, и дедуктивные методы, основанные на гипотезах, широко считаются единственным средством научного прогресса. Это во многом связано с техническими ограничениями измерения всего метаболома. Хотя методы, основанные на гипотезах, особенно полезны при выборе других причинно-следственных механизмов, их способность продвигать наше понимание биохимических сетей более ограничена, чем вычислительные методы, доступные в современной науке, основанной на больших данных. Поэтому теории, которые нельзя предсказать, выходят далеко за рамки имеющихся данных, поэтому цикл гипотетических формул/тестов прогресса в области исследований не может быть отменен (4). Мы предполагаем, что представленный здесь вычислительный рабочий процесс метаболомики может возродить интерес к недавним (как) и окончательным (почему) вопросам метаболического разнообразия и внести вклад в новую эру теоретически обоснованной науки о данных. Эта эра переосмыслила важные теории, которые вдохновляли предыдущие поколения.
Прямое питание травоядных насекомых проводилось путем выращивания личинки второй стадии развития (Sl-личинки) на одном листе бледно-окрашенного кувшинчатого растения одной цветущей розы, с 10 повторениями на каждом растении. Личинки насекомых захватывали зажимами, а оставшуюся ткань листа собирали через 24 и 72 часа после заражения, быстро замораживали и экстрагировали метаболиты.
Имитация обработки травоядными животными в высокосинхронизированном режиме. Метод заключается в использовании колесиков для нанесения рисунка на ткань, чтобы проколоть три ряда шипов с каждой стороны средней жилки трех полностью распустившихся листьев растения на стадии роста тканевой гирлянды, и немедленно нанести разбавленный в соотношении 1:5 раствор Ms. Или использовать пальцы в перчатках, чтобы ввести S1 OS в место прокола. Собрать и обработать лист, как описано выше. Использовать описанный ранее метод для извлечения первичных метаболитов и растительных гормонов (54).
Для экзогенного применения жасмоновой кислоты (ЖК) три черешка каждого из шести цветущих растений роз каждого вида обрабатывали 20 мкл ланолиновой пасты, содержащей 150 мкг метилжасмоната (Lan + MeJA), и 20 мкл ланолина с добавлением средства для обработки ран (Lan + W), или использовали 20 мкл чистого ланолина в качестве контроля. Листья собирали через 72 часа после обработки, быстро замораживали в жидком азоте и хранили при -80°C до использования.
В нашей исследовательской группе были идентифицированы четыре трансгенные линии JA и ET, а именно irAOC (36), irCOI1 (55), irACO и sETR1 (48). irAOC показал значительное снижение уровней JA и JA-Ile, в то время как irCOI1 не был чувствителен к JA. По сравнению с EV, накопление JA-Ile увеличилось. Аналогично, irACO снизит производство ET, а по сравнению с EV, sETR1, нечувствительный к ET, увеличит производство ET.
Для неинвазивного измерения эвапотранспирации используется фотоакустический лазерный спектрометр (датчик эвапотранспирации Sensor Sense ETD-300). Сразу после обработки половину листьев срезали и помещали в герметично закрытый стеклянный флакон объемом 4 мл, после чего в течение 5 часов давали образоваться свободному пространству над листом. Во время измерения каждый флакон в течение 8 минут продували потоком чистого воздуха со скоростью 2 литра в час, предварительно прошедшего через катализатор, предоставленный компанией Sensor Sense, для удаления CO2 и воды.
Данные микроматричного анализа были первоначально опубликованы в (35) и сохранены в Комплексной базе данных экспрессии генов Национального центра биотехнологической информации (NCBI) (номер доступа GSE30287). Для данного исследования были извлечены данные, соответствующие листьям, подвергшимся обработке W + OSMs, и неповрежденному контролю. Исходная интенсивность представлена ​​в логарифмическом масштабе по основанию 2. Перед статистическим анализом базовая линия была преобразована и нормализована до 75-го процентиля с использованием программного пакета R.
Исходные данные секвенирования РНК (RNA-seq) видов Nicotiana были получены из архива коротких прочтений NCBI (SRA), номер проекта PRJNA301787, о котором сообщали Чжоу и др. (39), и обработка проводилась, как описано в (56). Для анализа в данном исследовании были выбраны исходные данные, обработанные W + W, W + OSM и W + OSS1, соответствующие видам Nicotiana, и обработаны следующим образом: сначала исходные данные RNA-seq были преобразованы в формат FASTQ. HISAT2 преобразует FASTQ в SAM, а SAMtools преобразует файлы SAM в отсортированные файлы BAM. StringTie используется для расчета экспрессии генов, и его метод экспрессии основан на том, что количество фрагментов на тысячу оснований приходится на миллион секвенированных транскрипционных фрагментов.
Хроматографическая колонка Acclaim (150 мм x 2,1 мм; размер частиц 2,2 мкм), используемая в анализе, и защитная колонка 4 мм x 4 мм изготовлены из одного и того же материала. В системе высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) Dionex UltiMate 3000 используется следующий бинарный градиент: от 0 до 0,5 минут, изократический режим 90% A [деионизированная вода, 0,1% (об/об) ацетонитрила и 0,05% муравьиной кислоты], 10% B (ацетонитрил и 0,05% муравьиной кислоты); от 0,5 до 23,5 минут, градиентная фаза составляет 10% A и 90% B соответственно; от 23,5 до 25 минут, изократический режим 10% A и 90% B. Скорость потока составляет 400 мкл/мин. Для всех масс-спектрометрических анализов элюент из колонки следует вводить в квадрупольный времяпролетный анализатор (qTOF), оснащенный источником электрораспыления, работающим в режиме положительной ионизации (напряжение капилляра 4500 В; выходное напряжение капилляра 130 В; температура сушки 200 °C; поток воздуха для сушки 10 л/мин).
Проведите фрагментный анализ MS/MS (далее именуемый MS/MS), не имеющий отношения к данным или неотличимый от них, для получения структурной информации об общем обнаруживаемом метаболическом профиле. Концепция недискриминантного метода MS/MS основана на том факте, что квадруполь имеет очень большое окно изоляции масс [следовательно, все сигналы отношения массы к заряду (m/z) рассматриваются как фрагменты]. По этой причине, поскольку прибор Impact II не смог создать наклон CE, было проведено несколько независимых анализов с использованием повышенных значений энергии столкновения (CE) при диссоциации, индуцированной столкновениями. Вкратце, сначала проанализируйте образец методом ВЭЖХ-электрораспылительной ионизации/qTOF-MS в режиме одиночной масс-спектрометрии (условия низкой фрагментации, создаваемые внутриисточниковой фрагментацией), сканируя от m/z 50 до 1500 с частотой повторения 5 Гц. В качестве газа для столкновительной диссоциации при MS/MS-анализе используйте азот и проводите независимые измерения при следующих четырех различных напряжениях диссоциации, индуцированной столкновениями: 20, 30, 40 и 50 эВ. На протяжении всего процесса измерения квадруполь имеет наибольшее окно изоляции масс, от m/z 50 до 1500. Когда m/z переднего тела и ширина изоляции эксперимента установлены на 200, диапазон масс автоматически активируется программным обеспечением прибора и 0 Да. Сканируйте фрагменты масс, как в режиме одной массы. Используйте формиат натрия (50 мл изопропанола, 200 мкл муравьиной кислоты и 1 мл 1М водного раствора NaOH) для калибровки масс. Используя высокоточный алгоритм калибровки Bruker, файл данных калибруется после усреднения спектра за заданный период времени. Используйте функцию экспорта программного обеспечения Data Analysis v4.0 (Brook Dalton, Бремен, Германия) для преобразования исходных файлов данных в формат NetCDF. Набор данных MS/MS сохранен в открытой базе данных метаболомики MetaboLights (www.ebi.ac.uk) под номером доступа MTBLS1471.
Сборка MS/MS может быть реализована посредством корреляционного анализа между сигналами качества MS1 и MS/MS для низкой и высокой энергии столкновения, а также с помощью недавно внедренных правил. Для реализации корреляционного анализа распределения прекурсора по продукту используется скрипт на языке R, а для реализации правил — скрипт на языке C# (https://github.com/MPI-DL/indiscriminant-MS-MS-assembly-pipeline).
Для уменьшения количества ложноположительных ошибок, вызванных фоновым шумом и ложной корреляцией, возникающей из-за обнаружения определенных m/z-характеристик лишь в нескольких образцах, мы используем функцию «заполненный пик» из пакета R XCMS (для коррекции фонового шума) для замены интенсивности «NA» (необнаруженный пик). При использовании функции заполненного пика в наборе данных остается много значений интенсивности «0», которые будут влиять на расчет корреляции. Затем мы сравниваем результаты обработки данных, полученные при использовании функции заполненного пика и без нее, вычисляем значение фонового шума на основе среднего скорректированного оценочного значения, а затем заменяем эти значения интенсивности «0» вычисленным фоновым значением. Мы также учитываем только те характеристики, интенсивность которых в три раза превышает фоновое значение, и считаем их «истинными пиками». Для расчетов PCC учитываются только m/z-сигналы прекурсора образца (MS1) и наборы данных фрагментов, содержащие не менее восьми истинных пиков.
Если интенсивность характеристики качества прекурсора во всем образце значительно коррелирует с уменьшенной интенсивностью той же характеристики качества, подвергнутой воздействию низкой или высокой энергии столкновения, и эта характеристика не помечена CAMERA как изотопный пик, ее можно дополнительно определить. Затем, путем вычисления всех возможных пар прекурсор-продукт в течение 3 с (оценочное окно времени удерживания для пика), проводится корреляционный анализ. Фрагмент считается таковым только в том случае, если значение m/z ниже значения прекурсора и фрагментация MS/MS происходит в том же месте образца в наборе данных, что и прекурсор, из которого он получен.
На основе этих двух простых правил мы исключаем указанные фрагменты со значениями m/z, превышающими m/z идентифицированного прекурсора, а также на основе положения прекурсора в образце и указанного фрагмента. Также возможно выбрать качественные характеристики, полученные из множества фрагментов, сгенерированных в режиме MS1, в качестве потенциальных прекурсоров, что приводит к генерации избыточных соединений MS/MS. Для уменьшения этой избыточности данных, если сходство NDP спектров превышает 0,6 и они принадлежат к хроматограмме «pcgroup», аннотированной CAMERA, мы объединяем их. Наконец, мы объединяем все четыре результата CE, связанные с прекурсором и фрагментами, в окончательный деконволюированный составной спектр, выбирая пик с наибольшей интенсивностью среди всех потенциальных пиков с одинаковым значением m/z при разных энергиях столкновения. Последующие этапы обработки основаны на концепции составного спектра и учитывают различные условия КЭ, необходимые для максимизации вероятности фрагментации, поскольку некоторые фрагменты могут быть обнаружены только при определенной энергии столкновения.
RDPI (30) использовался для расчета индуцируемости метаболического профиля. Разнообразие метаболического спектра (индекс Hj) выводится из количества предшественников MS/MS с использованием энтропии Шеннона распределения частоты MS/MS с помощью следующего уравнения, описанного Мартинесом и др. (8). Hj = −∑i = 1mPijlog2(Pij), где Pij соответствует относительной частоте i-го MS/MS в j-м образце (j = 1, 2,…, m) (i = 1, 2, …, m) t).
Метаболическая специфичность (индекс Si) определяется как идентичность экспрессии данного MS/MS по отношению к частоте встречаемости между рассматриваемыми образцами. Специфичность MS/MS рассчитывается как Si = 1t (∑j = 1tPijPilog2PijPi)
Используйте следующую формулу для измерения специфического для метаболома индекса δj каждого образца j, а также среднего значения специфичности MS/MS δj = ∑i = 1mPijSi
MS/MS-спектры выравниваются попарно, и сходство рассчитывается на основе двух показателей. Сначала, используя стандартный метод NDP (также известный как метод косинусной корреляции), применяется следующее уравнение для оценки сходства сегментов между спектрами: NDP = (∑iS1 & S2WS1, iWS2, i) 2∑iWS1, i2∑iWS2, i2, где S1 и S2. Соответственно, для спектра 1 и спектра 2, а также WS1, i и WS2, i представляет собой вес, основанный на интенсивности пика, при которой разница i-го общего пика между двумя спектрами составляет менее 0,01 Да. Вес рассчитывается следующим образом: W = [интенсивность пика] m [качество] n, m = 0,5, n = 2, как предложено MassBank.
Был реализован второй метод оценки, включающий анализ общих NL между MS/MS. Для этого мы использовали 52 списка NL, часто встречающихся в процессе фрагментации MS, а также более специфический список NL (файл данных S1), который ранее был аннотирован для MS/MS-спектра вторичных метаболитов ослабленных видов Nepenthes (9, 26). Для каждого MS/MS был создан бинарный вектор из 1 и 0, соответствующий текущему и отсутствующему значению NL соответственно. На основе сходства евклидового расстояния для каждой пары бинарных векторов NL рассчитывался показатель сходства.
Для выполнения двойной кластеризации мы использовали пакет R DiffCoEx, основанный на расширении анализа взвешенной коэкспрессии генов (WGCNA). Используя матрицы оценок NDP и NL спектров MS/MS, мы использовали DiffCoEx для расчета сравнительной корреляционной матрицы. Бинарная кластеризация выполняется путем установки параметра “cutreDynamic” в значение method = “hybrid”, cutHeight = 0.9999, deepSplit = T и minClusterSize = 10. Исходный код R пакета DiffCoEx был загружен из дополнительного файла 1 Tesson et al. (57); необходимый пакет программного обеспечения R WGCNA можно найти по адресу https://horvath.genetics.ucla.edu/html/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA.
Для проведения анализа молекулярной сети MS/MS мы рассчитали парную спектральную связность на основе типов сходства NDP и NL и использовали программное обеспечение Cytoscape для визуализации топологии сети с использованием органической компоновки в приложении расширения алгоритма компоновки CyFilescape yFiles.
Для статистического анализа данных использовалась версия R 3.0.1. Статистическая значимость оценивалась с помощью двухфакторного дисперсионного анализа (ANOVA), за которым следовал апостериорный тест Тьюки (HSD). Для анализа различий между обработкой травоядными животными и контролем, двустороннее распределение двух групп образцов с одинаковой дисперсией анализировалось с помощью t-критерия Стьюдента.
Дополнительные материалы к этой статье можно найти по адресу http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/24/eaaz0381/DC1
Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution-Non-Commercial, которая разрешает использование, распространение и воспроизведение в любом формате при условии, что конечное использование не преследует коммерческой выгоды и что оригинальная работа является корректной. Ссылка.
Примечание: Мы просим вас указать адрес электронной почты только для того, чтобы человек, которого вы рекомендуете этой странице, знал, что вы хотите, чтобы он увидел это письмо, и что это не спам. Мы не будем собирать адреса электронной почты.
Этот вопрос используется для проверки того, являетесь ли вы посетителем, и предотвращения автоматической отправки спама.
Теория информации предоставляет универсальный инструмент для сравнения различных метаболомов и прогнозирования теорий защиты при тестировании.
Теория информации предоставляет универсальный инструмент для сравнения различных метаболомов и прогнозирования теорий защиты при тестировании.
©2021 Американская ассоциация содействия развитию науки. все права защищены. AAAS является партнером HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef и COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.