Ранее мы сообщали, что уровни индол-3-пропионовой кислоты (ИПА), метаболита триптофана, образующегося в кишечнике, в сыворотке крови ниже у пациентов с фиброзом печени. В данном исследовании мы изучили транскриптом и метилом ДНК в печени тучных пациентов в зависимости от уровней ИПА в сыворотке крови, а также роль ИПА в индукции фенотипической инактивации звездчатых клеток печени (ЗКП) in vitro.
В исследовании приняли участие 116 пациентов с ожирением без сахарного диабета 2 типа (СД2) (возраст 46,8 ± 9,3 года; ИМТ: 42,7 ± 5,0 кг/м²), перенесших бариатрическую операцию в Куопийском центре бариатрической хирургии (KOBS). Уровни циркулирующего IPA измерялись методом жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ЖХ-МС), анализ транскриптома печени проводился методом секвенирования общей РНК, а анализ метилирования ДНК — с использованием микрочипа Infinium HumanMethylation450 BeadChip. Для экспериментов in vitro использовались клетки звездчатой ​​печени человека (LX-2).
Уровни IPA в сыворотке коррелировали с экспрессией генов, участвующих в апоптозе, митофагии и процессах долголетия в печени. Ген серин/треонинкиназы AKT 1 (AKT1) был наиболее распространенным и доминирующим геном, взаимодействующим с клетками в профилях транскриптов и метилирования ДНК печени. Лечение IPA индуцировало апоптоз, снижало митохондриальное дыхание и изменяло морфологию клеток и митохондриальную динамику путем модуляции экспрессии генов, известных своей ролью в регуляции фиброза, апоптоза и выживания клеток LX-2.
В совокупности эти данные подтверждают, что IPA обладает потенциальным терапевтическим эффектом и может индуцировать апоптоз и сдвигать фенотип звездчатых клеток печени в сторону неактивного состояния, тем самым расширяя возможности ингибирования фиброза печени путем вмешательства в активацию звездчатых клеток печени и митохондриальный метаболизм.
Распространенность ожирения и метаболического синдрома связана с увеличением частоты метаболически ассоциированной жировой болезни печени (МАЖБП); это заболевание поражает от 25% до 30% населения [1]. Главным следствием этиологии МАЖБП является фиброз печени, динамический процесс, характеризующийся непрерывным накоплением фиброзного внеклеточного матрикса (ВКМ) [2]. Основными клетками, участвующими в фиброзе печени, являются звездчатые клетки печени (ЗКП), которые демонстрируют четыре известных фенотипа: покоящийся, активированный, инактивированный и стареющий [3, 4]. ЗКП могут активироваться и трансдифференцироваться из покоящейся формы в пролиферативные фибробластоподобные клетки с высокими энергетическими потребностями, с повышенной экспрессией α-гладкомышечного актина (α-ГМА) и коллагена I типа (Кол-I) [5, 6]. При обращении вспять фиброза печени активированные ЗКП элиминируются посредством апоптоза или инактивации. Эти процессы включают снижение активности фиброгенных генов и модуляцию генов, способствующих выживанию (таких как сигнальные пути NF-κB и PI3K/Akt) [7, 8], а также изменения в динамике и функции митохондрий [9].
Было обнаружено, что уровни сывороточного метаболита триптофана индол-3-пропионовой кислоты (ИПА), вырабатываемого в кишечнике, снижаются при метаболических заболеваниях человека, включая MASLD [10–13]. ИПА связана с потреблением пищевых волокон, известна своими антиоксидантными и противовоспалительными свойствами и ослабляет вызванный диетой фенотип неалкогольного стеатогепатита (НАСГ) in vivo и in vitro [11–14]. Некоторые данные получены в нашем предыдущем исследовании, которое показало, что уровни сывороточного ИПА были ниже у пациентов с фиброзом печени, чем у пациентов с ожирением без фиброза печени в исследовании бариатрической хирургии в Куопио (KOBS). Кроме того, мы показали, что лечение ИПА может снижать экспрессию генов, являющихся классическими маркерами клеточной адгезии, клеточной миграции и активации гемопоэтических стволовых клеток в модели человеческих звездчатых клеток печени (LX-2), и является потенциальным гепатопротекторным метаболитом [15]. Однако до сих пор неясно, каким образом IPA вызывает регрессию фиброза печени путем активации апоптоза звездчатых клеток печени и митохондриальной биоэнергетики.
В данном исследовании мы показали, что сывороточный IPA связан с экспрессией генов, обогащенных в путях апоптоза, митофагии и долголетия в печени тучных людей, не страдающих диабетом 2 типа (KOBS). Кроме того, мы обнаружили, что IPA может вызывать клиренс и деградацию активированных гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) посредством пути инактивации. Эти результаты выявляют новую роль IPA, делая его потенциальной терапевтической мишенью для стимуляции регрессии фиброза печени.
Предыдущее исследование в когорте KOBS показало, что у пациентов с фиброзом печени уровень циркулирующего IPA был ниже по сравнению с пациентами без фиброза печени [15]. Чтобы исключить потенциальное влияние диабета 2 типа, мы набрали 116 пациентов с ожирением без диабета 2 типа (средний возраст ± стандартное отклонение: 46,8 ± 9,3 года; ИМТ: 42,7 ± 5,0 кг/м2) (Таблица 1) из текущего исследования KOBS в качестве исследуемой популяции [16]. Все участники дали письменное информированное согласие, и протокол исследования был одобрен Комитетом по этике больницы округа Северный Саво в соответствии с Декларацией Хельсинки (54/2005, 104/2008 и 27/2010).
Образцы биопсии печени были получены во время бариатрической операции и гистологически оценены опытными патологоанатомами в соответствии с ранее описанными критериями [17, 18]. Критерии оценки суммированы в дополнительной таблице S1 и были описаны ранее [19].
Образцы сыворотки крови натощак анализировались методом нецелевой жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ЖХ-МС) для метаболомного анализа (n = 116). Образцы анализировались с использованием системы ВЭЖХ-кТОФ-МС (1290 ЖХ, 6540 кТОФ-МС, Agilent Technologies, Вальдбронн, Карлсруэ, Германия), как описано ранее19. Идентификация изопропилового спирта (ИПА) основывалась на времени удерживания и сравнении спектра МС/МС с чистыми стандартами. Интенсивность сигнала ИПА (площадь пика) учитывалась во всех дальнейших анализах [20].
Секвенирование РНК всей печени проводилось с использованием Illumina HiSeq 2500, а предварительная обработка данных осуществлялась, как описано ранее [19, 21, 22]. Мы провели целевой анализ дифференциальной экспрессии транскриптов, влияющих на функцию/биогенез митохондрий, используя 1957 генов, отобранных из базы данных MitoMiner 4.0 [23]. Анализ метилирования ДНК печени проводился с использованием Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, Сан-Диего, Калифорния, США) по той же методологии, что и описано ранее [24, 25].
Клетки звездчатой ​​печени человека (LX-2) были любезно предоставлены профессором Стефано Ромео и культивировались и поддерживались в среде DMEM/F12 (Biowest, L0093-500, 1% пенициллина/стрептомицина; Lonza, DE17-602E, 2% фетальной бычьей сыворотки; Gibco, 10270-106). Для выбора рабочей дозы IPA клетки LX-2 обрабатывали различными концентрациями IPA (10 мкМ, 100 мкМ и 1 мМ; Sigma, 220027) в среде DMEM/F12 в течение 24 часов. Кроме того, для исследования способности IPA инактивировать HSC, клетки LX-2 обрабатывали одновременно 5 нг/мл TGF-β1 (R&D systems, 240-B-002/CF) и 1 мМ IPA в бессывороточной среде в течение 24 часов. В качестве соответствующих контрольных растворов использовали 4 нМ HCl, содержащий 0,1% BSA, для обработки TGF-β1 и 0,05% DMSO для обработки IPA, причем оба раствора использовали вместе для комбинированной обработки.
Апоптоз оценивали с использованием набора для определения апоптоза FITC Annexin V с 7-AAD (Biolegend, Сан-Диего, Калифорния, США, кат. № 640922) в соответствии с инструкциями производителя. Кратко, клетки LX-2 (1 × 10⁵ клеток/лунка) культивировали в течение ночи в 12-луночных планшетах, а затем обрабатывали несколькими дозами IPA или IPA и TGF-β1. На следующий день плавающие и адгезивные клетки собирали, обрабатывали трипсином, промывали фосфатно-солевым буфером (PBS), ресуспендировали в буфере для связывания Annexin V и инкубировали с FITC-Annexin V и 7-AAD в течение 15 минут.
Митохондрии в живых клетках окрашивали для определения окислительной активности с использованием Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA). Для анализа с помощью MTR клетки LX-2 инкубировали при равной плотности с IPA и TGF-β1. Через 24 часа живые клетки обрабатывали трипсином, промывали PBS, а затем инкубировали с 100 мкМ MTR в бессывороточной среде при 37 °C в течение 20 мин, как описано ранее [26]. Для анализа морфологии живых клеток размер клеток и сложность цитоплазмы анализировали с использованием параметров прямого рассеяния (FSC) и бокового рассеяния (SSC) соответственно.
Все данные (30 000 событий) были получены с помощью NovoCyte Quanteon (Agilent) и проанализированы с использованием программного обеспечения NovoExpress® 1.4.1 или FlowJo V.10.
Скорость потребления кислорода (OCR) и скорость внеклеточного закисления (ECAR) измерялись в режиме реального времени с помощью анализатора внеклеточного потока Seahorse (Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния), оснащенного прибором Seahorse XF Cell Mito Stress, согласно инструкциям производителя. Кратко, 2 × 10⁴ клеток LX-2 на лунку высевали на чашки Петри с культурой клеток XF96. После ночной инкубации клетки обрабатывали изопропанолом (IPA) и TGF-β1 (дополнительные методы 1). Анализ данных проводили с помощью программного обеспечения Seahorse XF Wave, которое включает генератор отчетов о тестировании энергетического фенотипа клеток Seahorse XF. На основе этого рассчитывали индекс биоэнергетического здоровья (BHI) [27].
Общая РНК была транскрибирована в кДНК. Подробные методы см. в ссылке [15]. Уровни мРНК человеческого 60S рибосомального кислотного белка P0 (RPLP0) и циклофилина A1 (PPIA) использовались в качестве конститутивных генных контролей. Система ПЦР в реальном времени QuantStudio 6 pro (Thermo Fisher, Ландсмеер, Нидерланды) использовалась с набором TaqMan™ Fast Advanced Master Mix Kit (Applied Biosystems) или Sensifast SYBR Lo-ROX Kit (Bioline, BIO 94050), а относительная кратность экспрессии генов рассчитывалась с использованием параметров циклического сравнения значений Ct (ΔΔCt) и метода ∆∆Ct. Подробная информация о праймерах приведена в дополнительных таблицах S2 и S3.
Ядерная ДНК (нкДНК) и митохондриальная ДНК (мтДНК) были выделены с использованием набора DNeasy blood and tissue kit (Qiagen), как описано ранее [28]. Относительное количество мтДНК рассчитывалось путем вычисления отношения каждого целевого участка мтДНК к геометрическому среднему трех участков ядерной ДНК (мтДНК/нкДНК), как подробно описано в Дополнительных методах 2. Подробная информация о праймерах для мтДНК и нкДНК приведена в Дополнительной таблице S4.
Живые клетки окрашивали красителем Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) для визуализации межклеточных и внутриклеточных митохондриальных сетей. Клетки LX-2 (1 × 10⁴ клеток/лунка) культивировали на стеклянных предметных стеклах в соответствующих культуральных чашках со стеклянным дном (Ibidi GmbH, Martinsried, Германия). Через 24 часа живые клетки LX-2 инкубировали с 100 мкМ MTR в течение 20 минут при 37 °C, а ядра клеток окрашивали DAPI (1 мкг/мл, Sigma-Aldrich), как описано ранее [29]. Митохондриальные сети визуализировали с помощью инвертированного микроскопа Zeiss Axio Observer (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Йена, Германия), оснащенного конфокальным модулем Zeiss LSM 800, при температуре 37 °C во влажной атмосфере с 5% CO2, используя объектив 63×NA 1.3. Для каждого типа образца было получено десять изображений Z-серии. Каждая Z-серия содержит 30 срезов толщиной 9,86 мкм. Для каждого образца изображения десяти различных полей зрения были получены с помощью программного обеспечения ZEN 2009 (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Йена, Германия), а анализ морфологии митохондрий проводился с помощью программного обеспечения ImageJ (v1.54d) [30, 31] в соответствии с параметрами, подробно описанными в Дополнительных методах 3.
Клетки фиксировали 2% раствором глутаральдегида в 0,1 М фосфатном буфере, затем фиксировали 1% раствором тетраоксида осмия (Sigma Aldrich, MO, США), постепенно обезвоживали ацетоном (Merck, Дармштадт, Германия) и, наконец, заливали эпоксидной смолой. Готовили ультратонкие срезы и окрашивали 1% раствором ацетата уранила (Merck, Дармштадт, Германия) и 1% раствором цитрата свинца (Merck, Дармштадт, Германия). Ультраструктурные изображения получали с помощью просвечивающего электронного микроскопа JEM 2100F EXII (JEOL Ltd, Токио, Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ.
Морфологию клеток LX-2, обработанных IPA в течение 24 часов, анализировали с помощью фазово-контрастной микроскопии при 50-кратном увеличении с использованием инвертированного светового микроскопа Zeiss (Zeiss Axio Vert.A1 и AxioCam MRm, Йена, Германия).
Клинические данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение или медианы (межквартильный размах: IQR). Для сравнения различий между тремя группами исследования использовался однофакторный дисперсионный анализ (для непрерывных переменных) или критерий χ² (для категориальных переменных). Для коррекции множественных сравнений использовался критерий ложноположительных результатов (FDR), и гены с FDR < 0,05 считались статистически значимыми. Для корреляции метилирования ДНК CpG с интенсивностью сигнала IPA использовался корреляционный анализ Спирмена, при этом указывались номинальные значения p (p < 0,05).
Анализ сигнальных путей проводился с использованием веб-инструмента для анализа наборов генов (WebGestalt) для 268 транскриптов (номинальное p < 0,01), 119 транскриптов, ассоциированных с митохондриями (номинальное p < 0,05), и 4350 CpG-сайтов из 3093 транскриптов печени, которые были связаны с уровнями циркулирующего IPA в сыворотке крови. Для поиска перекрывающихся генов использовался свободно доступный инструмент Venny DB (версия 2.1.0), а для визуализации белково-белковых взаимодействий — StringDB (версия 11.5).
Для эксперимента LX-2 нормальность распределения образцов проверяли с помощью теста Д'Агостино-Пирсона. Данные были получены как минимум из трех биологических повторов и подвергнуты однофакторному дисперсионному анализу с последующим тестом Бонферрони. Значение p < 0,05 считалось статистически значимым. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение, а количество экспериментов указано на каждом рисунке. Все анализы и графики были выполнены с использованием статистического программного обеспечения GraphPad Prism 8 для Windows (GraphPad Software Inc., версия 8.4.3, Сан-Диего, США).
Сначала мы исследовали связь уровней IPA в сыворотке крови с транскриптами печени, всего организма и митохондрий. В общем профиле транскриптов наиболее сильно связанным с уровнями IPA в сыворотке крови геном был MAPKAPK3 (FDR = 0,0077; митоген-активированная протеинкиназа-активированная протеинкиназа 3); в профиле транскриптов, связанных с митохондриями, наиболее сильно связанным геном был AKT1 (FDR = 0,7621; AKT серин/треонинкиназа 1) (Дополнительный файл 1 и Дополнительный файл 2).
Затем мы проанализировали глобальные транскрипты (n = 268; p < 0,01) и транскрипты, связанные с митохондриями (n = 119; p < 0,05), в конечном итоге выявив апоптоз как наиболее значимый канонический путь (p = 0,0089). Что касается митохондриальных транскриптов, связанных с уровнями IPA в сыворотке, мы сосредоточились на апоптозе (FDR = 0,00001), митофагии (FDR = 0,00029) и сигнальных путях TNF (FDR = 0,000006) (Рисунок 1A, Таблица 2 и Дополнительные рисунки 1A-B).
Анализ перекрывающихся глобальных транскриптов, транскриптов, ассоциированных с митохондриями, и метилирования ДНК в печени человека в связи с уровнями IPA в сыворотке. A представляет 268 глобальных транскриптов, 119 транскриптов, ассоциированных с митохондриями, и метилированных транскриптов ДНК, которые картированы на 3092 CpG-сайта, ассоциированных с уровнями IPA в сыворотке (значения p < 0,01 для глобальных транскриптов и метилированных транскриптов ДНК и значения p < 0,05 для митохондриальных транскриптов). Основные перекрывающиеся транскрипты показаны в середине (AKT1 и YKT6). B Карта взаимодействия 13 генов с наивысшим баллом взаимодействия (0,900) с другими генами была построена на основе 56 перекрывающихся генов (область черной линии), которые были значительно ассоциированы с уровнями IPA в сыворотке, с использованием онлайн-инструмента StringDB. Зеленый цвет: гены, сопоставленные с клеточным компонентом онтологии генов (GO): митохондрии (GO:0005739). AKT1 — белок с наивысшим баллом (0,900) по взаимодействиям с другими белками на основе данных (полученных с помощью анализа текста, экспериментов, баз данных и совместной экспрессии). Узлы сети представляют белки, а ребра — связи между белками.
Поскольку метаболиты кишечной микробиоты могут регулировать эпигенетический состав посредством метилирования ДНК [32], мы исследовали, связаны ли уровни IPA в сыворотке с метилированием ДНК печени. Мы обнаружили, что два основных сайта метилирования, связанных с уровнями IPA в сыворотке, находятся вблизи богатого пролином и серином региона 3 (C19orf55) и члена 6 семейства белков теплового шока B (малый) (HSPB6) (Дополнительный файл 3). Метилирование ДНК 4350 CpG (p < 0,01) коррелировало с уровнями IPA в сыворотке и было обогащено в регуляторных путях долголетия (p = 0,006) (Рисунок 1A, Таблица 2 и Дополнительный рисунок 1C).
Для понимания биологических механизмов, лежащих в основе взаимосвязи между уровнями IPA в сыворотке, глобальными транскриптами, транскриптами, ассоциированными с митохондриями, и метилированием ДНК в печени человека, мы провели анализ перекрытия генов, выявленных в предыдущем анализе сигнальных путей (рисунок 1A). Результаты анализа обогащения сигнальных путей для 56 перекрывающихся генов (внутри черной линии на рисунке 1A) показали, что путь апоптоза (p = 0,00029) выделил два гена, общих для всех трех анализов: AKT1 и YKT6 (гомолог YKT6 v-SNARE), как показано на диаграмме Венна (дополнительный рисунок 2 и рисунок 1A). Интересно, что мы обнаружили положительную корреляцию между AKT1 (cg19831386) и YKT6 (cg24161647) и уровнями IPA в сыворотке (дополнительный файл 3). Для выявления потенциальных белковых взаимодействий между продуктами генов мы выбрали 13 генов с наивысшим баллом общего региона (0,900) среди 56 перекрывающихся генов в качестве входных данных и построили карту взаимодействий. В соответствии с уровнем достоверности (предельной достоверностью), ген AKT1 с наивысшим баллом (0,900) оказался на вершине (Рисунок 1B).
На основе анализа сигнальных путей мы обнаружили, что основным путем является апоптоз, поэтому мы исследовали, повлияет ли обработка IPA на апоптоз HSC in vitro. Ранее мы продемонстрировали, что различные дозы IPA (10 мкМ, 100 мкМ и 1 мМ) нетоксичны для клеток LX-2 [15]. В этом исследовании было показано, что обработка IPA в концентрациях 10 мкМ и 100 мкМ увеличивает количество жизнеспособных и некротических клеток. Однако по сравнению с контрольной группой жизнеспособность клеток снижалась при концентрации IPA 1 мМ, в то время как скорость некроза клеток оставалась неизменной (рис. 2A, B). Далее, чтобы найти оптимальную концентрацию для индукции апоптоза в клетках LX-2, мы протестировали 10 мкМ, 100 мкМ и 1 мМ IPA в течение 24 часов (рис. 2A-E и дополнительный рис. 3A-B). Интересно, что концентрации IPA 10 мкМ и 100 мкМ снижали скорость апоптоза (%), однако концентрация IPA 1 мМ увеличивала поздний апоптоз и скорость апоптоза (%) по сравнению с контролем, поэтому она была выбрана для дальнейших экспериментов (рисунки 2A–D).
IPA индуцирует апоптоз клеток LX-2. Для количественной оценки скорости апоптоза и морфологии клеток методом проточной цитометрии использовали двойное окрашивание аннексином V и 7-AAD. Клетки BA инкубировали с 10 мкМ, 100 мкМ и 1 мМ IPA в течение 24 ч или с F–H TGF-β1 (5 нг/мл) и 1 мМ IPA в бессывороточной среде в течение 24 ч. A: живые клетки (Annexin V -/ 7AAD-); B: некротические клетки (Annexin V -/ 7AAD+); C, F: ранняя стадия (Annexin V +/ 7AAD-); D, G: поздняя стадия (Annexin V+/7AAD+); E, H: процент от общего числа ранних и поздних апоптотических клеток в процентах от скорости апоптоза (%). Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение, n = 3 независимых эксперимента. Статистические сравнения проводились с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим апостериорным тестом Бонферрони. *p < 0,05; ****p < 0,0001
Как мы показали ранее, 5 нг/мл TGF-β1 может индуцировать активацию HSC за счет увеличения экспрессии классических маркерных генов [15]. Клетки LX-2 обрабатывали комбинацией 5 нг/мл TGF-β1 и 1 мМ IPA (рис. 2E–H). Обработка TGF-β1 не изменяла скорость апоптоза, однако совместная обработка IPA увеличивала поздний апоптоз и скорость апоптоза (%) по сравнению с обработкой только TGF-β1 (рис. 2E–H). Эти результаты показывают, что 1 мМ IPA может способствовать апоптозу в клетках LX-2 независимо от индукции TGF-β1.
Мы дополнительно исследовали влияние ИПА на митохондриальное дыхание в клетках LX-2. Результаты показали, что 1 мМ ИПА снижал параметры скорости потребления кислорода (СПК): немитохондриальное дыхание, базальное и максимальное дыхание, утечку протонов и производство АТФ по сравнению с контрольной группой (рис. 3А, В), в то время как индекс биоэнергетического здоровья (ИБЗ) не изменялся.
ИПА снижает митохондриальное дыхание в клетках LX-2. Кривая митохондриального дыхания (OCR) представлена ​​в виде параметров митохондриального дыхания (немитохондриальное дыхание, базальное дыхание, максимальное дыхание, утечка протонов, генерация АТФ, SRC и BHI). Клетки A и B инкубировали с 10 мкМ, 100 мкМ и 1 мМ ИПА в течение 24 ч соответственно. Клетки C и D инкубировали с TGF-β1 (5 нг/мл) и 1 мМ ИПА в бессывороточной среде в течение 24 ч соответственно. Все измерения были нормализованы по содержанию ДНК с использованием набора CyQuant. BHI: индекс биоэнергетического здоровья; SRC: резервная дыхательная способность; OCR: скорость потребления кислорода. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (SD), n = 5 независимых экспериментов. Статистические сравнения проводились с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) и апостериорного теста Бонферрони. *p < 0,05; **p < 0,01; и ***p < 0,001
Для более полного понимания влияния IPA на биоэнергетический профиль клеток LX-2, активированных TGF-β1, мы проанализировали митохондриальное окислительное фосфорилирование методом OCR (рис. 3C,D). Результаты показали, что обработка TGF-β1 может снизить максимальное дыхание, резервную дыхательную способность (SRC) и BHI по сравнению с контрольной группой (рис. 3C,D). Кроме того, комбинированное лечение снизило базальное дыхание, утечку протонов и выработку АТФ, но SRC и BHI были значительно выше, чем при обработке только TGF-β1 (рис. 3C,D).
Мы также провели «Тест фенотипа клеточной энергии», предоставленный программным обеспечением Seahorse (дополнительные рисунки 4A–D). Как показано на дополнительном рисунке 3B, метаболический потенциал OCR и ECAR снизился после обработки TGF-β1, однако в группах, получавших комбинированное лечение и лечение IPA, различий по сравнению с контрольной группой не наблюдалось. Кроме того, как базальный, так и стрессовый уровни OCR снизились после комбинированного лечения и лечения IPA по сравнению с контрольной группой (дополнительный рисунок 4C). Интересно, что аналогичная картина наблюдалась при комбинированной терапии, где не наблюдалось изменений базального и стрессового уровней ECAR по сравнению с лечением TGF-β1 (дополнительный рисунок 4C). В HSC снижение митохондриального окислительного фосфорилирования и способность комбинированного лечения восстанавливать SCR и BHI после воздействия TGF-β1 не изменили метаболический потенциал (OCR и ECAR). В совокупности эти результаты указывают на то, что IPA может снижать биоэнергетику в ГСК, предполагая, что IPA может вызывать более низкий энергетический профиль, который сдвигает фенотип ГСК в сторону инактивации (дополнительный рисунок 4D).
Влияние IPA на динамику митохондрий исследовали с помощью трехмерной количественной оценки морфологии митохондрий и сетевых связей, а также окрашивания MTR (рисунок 4 и дополнительный рисунок 5). На рисунке 4 показано, что по сравнению с контрольной группой обработка TGF-β1 уменьшила среднюю площадь поверхности, количество ветвей, общую длину ветвей и количество соединений ветвей (рисунок 4A и B) и изменила долю митохондрий со сферической на промежуточную морфологию (рисунок 4C). Только обработка IPA уменьшила средний объем митохондрий и изменила долю митохондрий со сферической на промежуточную морфологию по сравнению с контрольной группой (рисунок 4A). В отличие от этого, сферичность, средняя длина ветвей и митохондриальная активность, оцениваемая с помощью MTR, зависящего от митохондриального мембранного потенциала (рисунок 4A и E), остались неизменными, и эти параметры не различались между группами. В совокупности эти результаты позволяют предположить, что обработка TGF-β1 и IPA, по-видимому, модулирует форму и размер митохондрий, а также сложность их сети в живых клетках LX-2.
IPA изменяет динамику митохондрий и количество митохондриальной ДНК в клетках LX-2. A. Репрезентативные конфокальные изображения живых клеток LX-2, инкубированных с TGF-β1 (5 нг/мл) и 1 мМ IPA в течение 24 ч в бессывороточной среде, демонстрирующие митохондриальные сети, окрашенные Mitotracker™ Red CMXRos, и ядра, окрашенные синим DAPI. Все данные содержали не менее 15 изображений на группу. Мы получили 10 изображений Z-стека для каждого типа образца. Каждая последовательность по оси Z содержала 30 срезов толщиной 9,86 мкм. Масштабная линейка: 10 мкм. B. Репрезентативные объекты (только митохондрии), идентифицированные путем применения адаптивной пороговой обработки к изображению. Количественный анализ и сравнение морфологических связей митохондриальной сети были выполнены для всех клеток в каждой группе. C. Частота соотношений форм митохондрий. Значения, близкие к 0, указывают на сферическую форму, а значения, близкие к 1, — на нитевидную форму. D. Содержание митохондриальной ДНК (мтДНК) определяли, как описано в разделе «Материалы и методы». E. Анализ Mitotracker™ Red CMXRos проводили методом проточной цитометрии (30 000 событий), как описано в разделе «Материалы и методы». Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение, n = 3 независимых эксперимента. Статистические сравнения проводили с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) и апостериорного теста Бонферрони. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Затем мы проанализировали содержание мтДНК в клетках LX-2 как индикатор количества митохондрий. По сравнению с контрольной группой, содержание мтДНК увеличилось в группе, получавшей TGF-β1 (рис. 4D). По сравнению с группой, получавшей TGF-β1, содержание мтДНК уменьшилось в группе комбинированного лечения (рис. 4D), что предполагает, что IPA может снижать содержание мтДНК и, возможно, количество митохондрий, а также митохондриальное дыхание (рис. 3C). Более того, IPA, по-видимому, снижал содержание мтДНК при комбинированном лечении, но не влиял на митохондриальную активность, опосредованную MTR (рис. 4A–C).
Мы исследовали связь IPA с уровнями мРНК генов, связанных с фиброзом, апоптозом, выживаемостью и митохондриальной динамикой в ​​клетках LX-2 (рисунок 5A–D). По сравнению с контрольной группой, в группе, получавшей TGF-β1, наблюдалось увеличение экспрессии таких генов, как α2-цепь коллагена I типа (COL1A2), α-гладкомышечный актин (αSMA), матриксная металлопротеиназа 2 (MMP2), тканевой ингибитор металлопротеиназы 1 (TIMP1) и ген, подобный динамину 1 (DRP1), что указывает на усиление фиброза и активации. Кроме того, по сравнению с контрольной группой, лечение TGF-β1 снизило уровни мРНК ядерного прегнанового рецептора X (PXR), каспазы 8 (CASP8), MAPKAPK3, ингибитора B-клеточного α, усилителя легкого пептида гена ядерного фактора κ (NFκB1A) и ингибитора субъединицы β киназы ядерного фактора κB (IKBKB) (рисунок 5A–D). По сравнению с лечением TGF-β1, комбинированное лечение TGF-β1 и IPA снизило экспрессию COL1A2 и MMP2, но повысило уровни мРНК PXR, TIMP1, B-клеточной лимфомы-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β и IKBKB. Лечение IPA значительно снизило экспрессию MMP2, ассоциированного с Bcl-2 белка X (BAX), AKT1, белка оптической атрофии 1 (OPA1) и митохондриального белка слияния 2 (MFN2), в то время как экспрессия CASP8, NFκB1A, NFκB1B и IKBKB увеличилась по сравнению с контрольной группой. Однако не было обнаружено различий в экспрессии каспазы-3 (CASP3), фактора активации апоптотической пептидазы 1 (APAF1), митохондриального белка слияния 1 (MFN1) и белка деления 1 (FIS1). В совокупности эти результаты свидетельствуют о том, что лечение IPA модулирует экспрессию генов, связанных с фиброзом, апоптозом, выживанием и митохондриальной динамикой. Наши данные показывают, что лечение IPA снижает фиброз в клетках LX-2; в то же время оно стимулирует выживание, смещая фенотип в сторону инактивации.
IPA модулирует экспрессию генов фибробластов, апоптоза, жизнеспособности и митохондриальной динамики в клетках LX-2. Гистограммы показывают экспрессию мРНК относительно эндогенного контроля (RPLP0 или PPIA) после индукции клеток LX-2 TGF-β1 и IPA в бессывороточной среде в течение 24 часов. A обозначает фибробласты, B — апоптотические клетки, C — выжившие клетки, а D — экспрессию генов митохондриальной динамики. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (SD), n = 3 независимых эксперимента. Статистические сравнения проводились с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) и апостериорного теста Бонферрони. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Затем с помощью проточной цитометрии были оценены изменения размера клеток (FSC-H) и цитоплазматической сложности (SSC-H) (рис. 6A,B), а изменения морфологии клеток после обработки IPA были оценены с помощью трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ) и фазово-контрастной микроскопии (дополнительный рис. 6A-B). Как и ожидалось, клетки в группе, обработанной TGF-β1, увеличились в размере по сравнению с контрольной группой (рис. 6A,B), демонстрируя классическое расширение шероховатого эндоплазматического ретикулума (ER*) и фаголизосом (P), что указывает на активацию гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) (дополнительный рис. 6A). Однако по сравнению с группой, обработанной TGF-β1, размер клеток, цитоплазматическая сложность (рис. 6A,B) и содержание ER* уменьшились в группе, обработанной комбинацией TGF-β1 и IPA (дополнительный рис. 6A). Кроме того, обработка ИПА привела к уменьшению размера клеток, цитоплазматической сложности (рис. 6А,В), содержания P и ER* (дополнительный рис. 6А) по сравнению с контрольной группой. Также, после 24 часов обработки ИПА, содержание апоптотических клеток увеличилось по сравнению с контрольной группой (белые стрелки, дополнительный рис. 6B). В совокупности эти результаты свидетельствуют о том, что 1 мМ ИПА может стимулировать апоптоз ГСК и обращать вспять изменения морфологических параметров клеток, вызванные TGF-β1, тем самым регулируя размер и сложность клеток, что может быть связано с инактивацией ГСК.
IPA изменяет размер клеток и цитоплазматическую сложность в клетках LX-2. Репрезентативные изображения анализа методом проточной цитометрии. В анализе использовалась стратегия гейтирования, специфичная для клеток LX-2: SSC-A/FSC-A для определения популяции клеток, FSC-H/FSC-A для идентификации дублетов и SSC-H/FSC-H для анализа размера и сложности клеток. Клетки инкубировали с TGF-β1 (5 нг/мл) и 1 мМ IPA в бессывороточной среде в течение 24 часов. Клетки LX-2 распределяли в нижний левый квадрант (SSC-H-/FSC-H-), верхний левый квадрант (SSC-H+/FSC-H-), нижний правый квадрант (SSC-H-/FSC-H+) и верхний правый квадрант (SSC-H+/FSC-H+) для анализа размера клеток и цитоплазматической сложности. B. Морфология клеток анализировалась методом проточной цитометрии с использованием FSC-H (прямое рассеяние, размер клетки) и SSC-H (боковое рассеяние, сложность цитоплазмы) (30 000 событий). Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение, n = 3 независимых эксперимента. Статистические сравнения проводились с использованием однофакторного дисперсионного анализа и апостериорного теста Бонферрони. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 и ****p < 0,0001
Метаболиты кишечника, такие как IPA, стали предметом активных исследований, предполагающих обнаружение новых мишеней в кишечной микробиоте. Поэтому интересно, что IPA, метаболит, который мы связали с фиброзом печени у человека [15], был показан как потенциальное антифибротическое соединение в экспериментах на животных [13, 14]. Здесь мы впервые демонстрируем связь между сывороточным IPA и глобальной транскриптомикой печени и метилированием ДНК у тучных людей без диабета 2 типа (СД2), подчеркивая апоптоз, митофагию и долголетие, а также возможный ген-кандидат AKT1, регулирующий гомеостаз печени. Еще одна новинка нашего исследования заключается в том, что мы продемонстрировали взаимодействие лечения IPA с апоптозом, морфологией клеток, митохондриальной биоэнергетикой и динамикой в ​​клетках LX-2, указывая на более низкий энергетический спектр, который сдвигает фенотип HSC в сторону инактивации, что делает IPA потенциальным кандидатом для улучшения фиброза печени.
Мы обнаружили, что апоптоз, митофагия и долголетие являются наиболее важными каноническими путями, обогащенными генами печени, связанными с циркулирующим сывороточным IPA. Нарушение системы контроля качества митохондрий (MQC) может привести к митохондриальной дисфункции, митофагии и апоптозу, тем самым способствуя возникновению MASLD [33, 34]. Поэтому мы можем предположить, что IPA может участвовать в поддержании динамики клеток и целостности митохондрий посредством апоптоза, митофагии и долголетия в печени. Наши данные показали, что два гена были общими для всех трех анализов: YKT6 и AKT1. Стоит отметить, что YKT6 — это белок SNARE, участвующий в процессе слияния клеточных мембран. Он играет роль в аутофагии и митофагии, образуя инициационный комплекс с STX17 и SNAP29 на аутофагосоме, тем самым способствуя слиянию аутофагосом и лизосом [35]. Кроме того, потеря функции YKT6 приводит к нарушению митофагии [36], в то время как повышение уровня YKT6 связано с прогрессированием гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК), демонстрируя повышенную выживаемость клеток [37]. С другой стороны, AKT1 является наиболее важным взаимодействующим геном и играет важную роль в заболеваниях печени, включая сигнальный путь PI3K/AKT, клеточный цикл, миграцию клеток, пролиферацию, фокальную адгезию, функцию митохондрий и секрецию коллагена [38–40]. Активированный сигнальный путь PI3K/AKT может активировать гемопоэтические стволовые клетки (ГСК), которые являются клетками, ответственными за производство внеклеточного матрикса (ВКМ), и его дисрегуляция может способствовать возникновению и прогрессированию фиброза печени [40]. Кроме того, AKT является одним из ключевых факторов выживания клеток, который ингибирует p53-зависимый апоптоз клеток, и активация AKT может быть связана с ингибированием апоптоза клеток печени [41, 42]. Полученные результаты предполагают, что IPA может быть вовлечен в апоптоз, связанный с митохондриями печени, влияя на решение гепатоцитов о переходе к апоптозу или выживанию. Эти эффекты могут регулироваться кандидатными генами AKT и/или YKT6, которые имеют решающее значение для гомеостаза печени.
Наши результаты показали, что 1 мМ IPA индуцирует апоптоз и снижает митохондриальное дыхание в клетках LX-2 независимо от обработки TGF-β1. Следует отметить, что апоптоз является основным путем разрешения фиброза и активации гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), а также ключевым событием в обратимом физиологическом ответе на фиброз печени [4, 43]. Более того, восстановление BHI в клетках LX-2 после комбинированного лечения дало новые представления о потенциальной роли IPA в регуляции митохондриальной биоэнергетики. В состоянии покоя и неактивности гемопоэтические клетки обычно используют митохондриальное окислительное фосфорилирование для производства АТФ и обладают низкой метаболической активностью. С другой стороны, активация ГСК усиливает митохондриальное дыхание и биосинтез для компенсации энергетических потребностей при переходе в гликолитическое состояние [44]. Тот факт, что ИПА не влиял на метаболический потенциал и ECAR, предполагает, что гликолитический путь менее приоритетен. Аналогично, другое исследование показало, что 1 мМ ИПА способен модулировать активность митохондриальной дыхательной цепи в кардиомиоцитах, линии клеток гепатоцитов человека (Huh7) и эндотелиальных клетках пупочной вены человека (HUVEC); однако не было обнаружено влияния ИПА на гликолиз в кардиомиоцитах, что предполагает, что ИПА может влиять на биоэнергетику других типов клеток [45]. Поэтому мы предполагаем, что 1 мМ ИПА может действовать как мягкий химический разобщитель, поскольку он может значительно снижать экспрессию фиброгенных генов, морфологию клеток и митохондриальную биоэнергетику без изменения количества мтДНК [46]. Митохондриальные разобщители могут ингибировать фиброз, индуцированный культивированием, и активацию ГСК [47] и снижать выработку митохондриального АТФ, регулируемую или индуцируемую определенными белками, такими как разобщающие белки (UCP) или адениннуклеотидтранслоказа (ANT). В зависимости от типа клеток это явление может защищать клетки от апоптоза и/или способствовать апоптозу [46]. Однако необходимы дальнейшие исследования для выяснения роли IPA как митохондриального разобщителя в инактивации гемопоэтических стволовых клеток.
Затем мы исследовали, отражаются ли изменения в митохондриальном дыхании на морфологии митохондрий в живых клетках LX-2. Интересно, что обработка TGF-β1 изменяет соотношение митохондрий от сферических к промежуточным, с уменьшением ветвления митохондрий и увеличением экспрессии DRP1, ключевого фактора митохондриального деления [48]. Кроме того, фрагментация митохондрий связана с общей сложностью сети, а переход от слияния к делению имеет решающее значение для активации гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), тогда как ингибирование митохондриального деления приводит к апоптозу ГСК [49]. Таким образом, наши результаты показывают, что обработка TGF-β1 может вызывать снижение сложности митохондриальной сети с уменьшением ветвления, что чаще встречается при митохондриальном делении, связанном с активированными гемопоэтическими стволовыми клетками (ГСК). Кроме того, наши данные показали, что IPA может изменять соотношение митохондрий от сферической до промежуточной формы, тем самым снижая экспрессию OPA1 и MFN2. Исследования показали, что снижение экспрессии OPA1 может привести к уменьшению митохондриального мембранного потенциала и запуску апоптоза клеток [50]. Известно, что MFN2 опосредует слияние митохондрий и апоптоз [51]. Полученные результаты свидетельствуют о том, что индукция клеток LX-2 с помощью TGF-β1 и/или IPA, по-видимому, модулирует форму и размер митохондрий, а также состояние активации и сложность сети.
Наши результаты показывают, что комбинированное лечение TGFβ-1 и IPA может снижать уровень мтДНК и морфологические параметры клеток за счет регуляции экспрессии мРНК генов, связанных с фиброзом, апоптозом и выживанием, в клетках, избегающих апоптоза. Действительно, IPA снижал уровень экспрессии мРНК AKT1 и важных генов фиброза, таких как COL1A2 и MMP2, но повышал уровень экспрессии CASP8, связанного с апоптозом. Наши результаты показали, что после лечения IPA экспрессия BAX снижалась, а экспрессия мРНК субъединиц семейства TIMP1, BCL-2 и NF-κB увеличивалась, что предполагает, что IPA может стимулировать сигналы выживания в гемопоэтических стволовых клетках (ГСК), избегающих апоптоза. Эти молекулы могут действовать как сигналы выживания в активированных гемопоэтических стволовых клетках, что может быть связано с повышенной экспрессией антиапоптотических белков (таких как Bcl-2), сниженной экспрессией проапоптотического BAX и сложным взаимодействием между TIMP и NF-κB [5, 7]. IPA оказывает свое действие через PXR, и мы обнаружили, что комбинированное лечение TGF-β1 и IPA увеличивает уровни экспрессии мРНК PXR, что указывает на подавление активации HSC. Известно, что активированная сигнализация PXR ингибирует активацию HSC как in vivo, так и in vitro [52, 53]. Наши результаты показывают, что IPA может участвовать в удалении активированных HSC, способствуя апоптозу, уменьшая фиброз и митохондриальный метаболизм, а также усиливая сигналы выживания, которые являются типичными процессами, преобразующими фенотип активированных HSC в инактивированный. Еще одно возможное объяснение потенциального механизма и роли IPA в апоптозе заключается в том, что он нейтрализует дисфункциональные митохондрии, главным образом, посредством митофагии (внутренний путь) и внешнего сигнального пути TNF (таблица 1), который напрямую связан с сигнальным путем выживания NF-κB (дополнительный рисунок 7). Интересно, что гены, обогащенные генами, связанными с IPA, способны индуцировать проапоптотические и провыживательные сигналы в апоптотическом пути [54], что предполагает, что IPA может индуцировать апоптотический путь или выживание, взаимодействуя с этими генами. Однако, как именно IPA индуцирует апоптоз или выживание во время активации HSC и каковы его механистические пути, остается неясным.
ИПА — это микробный метаболит, образующийся из пищевого триптофана в кишечной микробиоте. Исследования показали, что он обладает противовоспалительными, антиоксидантными и эпигенетическими регуляторными свойствами в кишечной среде.[55] Исследования показали, что ИПА может модулировать функцию кишечного барьера и снижать окислительный стресс, что может способствовать его местным физиологическим эффектам.[56] Фактически, ИПА транспортируется к целевым органам через кровообращение, и поскольку ИПА имеет схожую структуру основного метаболита с триптофаном, серотонином и производными индола, ИПА оказывает метаболическое воздействие, приводящее к конкуренции метаболических путей.[52] ИПА может конкурировать с метаболитами, полученными из триптофана, за места связывания на ферментах или рецепторах, потенциально нарушая нормальные метаболические пути. Это подчеркивает необходимость дальнейших исследований его фармакокинетики и фармакодинамики для лучшего понимания его терапевтического окна.[57] Остается выяснить, может ли это также происходить в гемопоэтических стволовых клетках (ГСК).
Мы признаем, что наше исследование имеет некоторые ограничения. Для целенаправленного изучения взаимосвязей, связанных с IPA, мы исключили пациентов с сахарным диабетом 2 типа (СД2). Мы признаем, что это ограничивает широкую применимость наших результатов к пациентам с сахарным диабетом 2 типа и запущенным заболеванием печени. Хотя физиологическая концентрация IPA в сыворотке крови человека составляет 1–10 мкМ [11, 20], концентрация 1 мМ IPA была выбрана на основе самой высокой нетоксичной концентрации [15] и самой высокой скорости апоптоза, без различий в проценте некротической популяции клеток. Хотя в этом исследовании использовались сверхфизиологические уровни IPA, в настоящее время нет единого мнения относительно эффективной дозы IPA [52]. Хотя наши результаты являются значимыми, более широкая метаболическая судьба IPA остается активной областью исследований. Более того, наши данные о связи между уровнями IPA в сыворотке и метилированием ДНК транскриптов печени были получены не только из гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), но и из тканей печени. Мы выбрали для исследования клетки LX-2 человека, основываясь на наших предыдущих результатах транскриптомного анализа, показавших, что IPA связан с активацией гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) [15], а ГСК являются основными клетками, участвующими в прогрессировании фиброза печени. Печень состоит из множества типов клеток, поэтому для изучения роли IPA и его взаимодействия с другими типами клеток печени следует рассмотреть другие клеточные модели, такие как система совместного культивирования гепатоцитов-ГСК-иммунных клеток в сочетании с активацией каспазы и фрагментацией ДНК, а также механизм действия, включая уровень белка.