Спасибо за посещение сайта Nature.com. Версия используемого вами браузера имеет ограниченную поддержку CSS. Для достижения наилучших результатов мы рекомендуем использовать более новую версию вашего браузера (или отключить режим совместимости в Internet Explorer). В настоящее время, для обеспечения дальнейшей поддержки, сайт отображается без стилей и JavaScript.
Загрязнение кадмием (Cd) представляет потенциальную угрозу для безопасности выращивания лекарственного растения Panax notoginseng в провинции Юньнань. В условиях экзогенного стресса, вызванного Cd, ​​были проведены полевые эксперименты для изучения влияния внесения извести (0, 750, 2250 и 3750 кг/ч/м2) и внекорневой подкормки щавелевой кислотой (0, 0,1 и 0,2 моль/л) на накопление Cd и антиоксидантные системные и лекарственные компоненты Panax notoginseng. Результаты показали, что в условиях стресса, вызванного Cd, ​​внесение извести и внекорневая подкормка щавелевой кислотой могут увеличить содержание Ca2+ в Panax notoginseng и снизить токсичность Cd2+. Добавление извести и щавелевой кислоты повысило активность антиоксидантных ферментов и изменило метаболизм осмотических регуляторов. Наиболее значительным является увеличение активности CAT в 2,77 раза. Под воздействием щавелевой кислоты активность СОД увеличилась в 1,78 раза. Содержание МДА снизилось на 58,38%. Наблюдается очень значительная корреляция с растворимыми сахарами, свободными аминокислотами, пролином и растворимыми белками. Известь и щавелевая кислота могут увеличить содержание ионов кальция (Ca2+) в Panax notoginseng, снизить содержание Cd, повысить стрессоустойчивость Panax notoginseng и увеличить выработку общих сапонинов и флавоноидов. Содержание Cd является самым низким, на 68,57% ниже, чем в контроле, и соответствует стандартному значению (Cd≤0,5 мг кг-1, GB/T 19086-2008). Доля СПН составила 7,73%, достигнув наивысшего уровня среди всех вариантов обработки, а содержание флавоноидов значительно увеличилось на 21,74%, достигнув стандартных медицинских значений и оптимального выхода.
Кадмий (Cd) является распространенным загрязнителем обрабатываемых почв, легко мигрирует и обладает значительной биологической токсичностью. Эль-Шафеи и др.² сообщили, что токсичность кадмия влияет на качество и продуктивность используемых растений. В последние годы чрезмерное содержание кадмия в обрабатываемых почвах на юго-западе Китая стало серьезной проблемой. Провинция Юньнань является царством биоразнообразия Китая, занимая первое место в стране по количеству лекарственных растений. Однако провинция Юньнань богата минеральными ресурсами, и процесс добычи полезных ископаемых неизбежно приводит к загрязнению почвы тяжелыми металлами, что влияет на производство местных лекарственных растений.
Panax notoginseng (Burkill) Chen3) — очень ценное многолетнее травянистое лекарственное растение, принадлежащее к роду Panax семейства Araliaceae. Panax notoginseng улучшает кровообращение, устраняет застой крови и облегчает боль. Основной район выращивания — префектура Вэньшань, провинция Юньнань5. Более 75% почвы в местных районах выращивания Panax notoginseng загрязнено кадмием, причем его уровень варьируется от 81% до более 100% в разных районах6. Токсическое действие Cd также значительно снижает выработку лекарственных компонентов Panax notoginseng, особенно сапонинов и флавоноидов. Сапонины — это тип гликозидных соединений, агликоны которых представляют собой тритерпеноиды или спиростаны. Они являются основными активными ингредиентами многих традиционных китайских лекарств и содержат сапонины. Некоторые сапонины также обладают антибактериальной активностью или ценными биологическими свойствами, такими как жаропонижающее, седативное и противораковое действие7. Флавоноиды обычно представляют собой ряд соединений, в которых два бензольных кольца с фенольными гидроксильными группами соединены через три центральных атома углерода. Основным ядром является 2-фенилхроманон8. Это сильный антиоксидант, который может эффективно нейтрализовать свободные радикалы кислорода в растениях. Он также может ингибировать проникновение воспалительных биологических ферментов, способствовать заживлению ран и облегчению боли, а также снижать уровень холестерина. Это один из основных активных ингредиентов Panax notoginseng. Существует острая необходимость в решении проблемы загрязнения почв кадмием в районах выращивания Panax ginseng и обеспечении производства его основных лекарственных компонентов.
Известь является одним из широко используемых пассиваторов для стационарной очистки почвы от загрязнения кадмием10. Она влияет на адсорбцию и осаждение Cd в почве, снижая биодоступность Cd в почве за счет повышения значения pH и изменения емкости катионного обмена почвы (ЕКО), насыщенности почвы солью (СЗ) и окислительно-восстановительного потенциала почвы (ЭХ)3, 11. Кроме того, известь обеспечивает большое количество Ca2+, образует ионный антагонизм с Cd2+, конкурирует за места адсорбции в корнях, предотвращает транспорт Cd в почву и обладает низкой биологической токсичностью. При добавлении 50 ммоль/л Ca в условиях стресса, вызванного Cd, ​​транспорт Cd в листьях кунжута был подавлен, а накопление Cd снизилось на 80%. Ряд аналогичных исследований был проведен на рисе (Oryza sativa L.) и других культурах12,13.
Внекорневая обработка сельскохозяйственных культур для контроля накопления тяжелых металлов — это новый метод борьбы с тяжелыми металлами, появившийся в последние годы. Его принцип в основном связан с реакцией хелатирования в растительных клетках, в результате которой тяжелые металлы откладываются на клеточной стенке и ингибируют поглощение тяжелых металлов растениями14,15. Щавелевая кислота, как стабильный дикислотный хелатирующий агент, может непосредственно хелатировать ионы тяжелых металлов в растениях, тем самым снижая токсичность. Исследования показали, что щавелевая кислота в соевых бобах может хелатировать Cd2+ и высвобождать содержащие Cd кристаллы через верхние клетки трихом, снижая уровень Cd2+ в организме16. Щавелевая кислота может регулировать pH почвы, усиливать активность супероксиддисмутазы (СОД), пероксидазы (ПОД) и каталазы (КАТ), а также регулировать проникновение растворимых сахаров, растворимых белков, свободных аминокислот и пролина. Метаболические регуляторы17,18. Кислота и избыток Ca2+ в растении под действием нуклеирующих белков образуют осадок оксалата кальция. Регулирование концентрации Ca2+ в растениях позволяет эффективно регулировать содержание растворенной щавелевой кислоты и Ca2+ в растениях и предотвращать чрезмерное накопление щавелевой кислоты и Ca2+19,20.
Количество вносимой извести является одним из ключевых факторов, влияющих на восстановительный эффект. Было установлено, что дозировка извести варьировалась от 750 до 6000 кг/м2. Для кислых почв с pH 5,0–5,5 эффект от внесения извести в дозе 3000–6000 кг/ч/м2 значительно выше, чем при дозе 750 кг/ч/м221. Однако чрезмерное внесение извести может привести к некоторым негативным последствиям для почвы, таким как значительные изменения pH почвы и ее уплотнение22. Поэтому мы определили уровни обработки CaO как 0, 750, 2250 и 3750 кг·ч·м⁻². При внесении щавелевой кислоты в Arabidopsis thaliana было обнаружено, что концентрация Ca2+ значительно снижалась при концентрации 10 ммоль/л, и семейство генов CRT, влияющее на передачу сигналов Ca2+, сильно реагировало20. Накопленные ранее данные исследований позволили определить концентрацию данного препарата и дополнительно изучить влияние взаимодействия экзогенных добавок на Ca2+ и Cd2+23,24,25. Таким образом, целью данного исследования является изучение механизма регуляции содержания Cd и стрессоустойчивости Panax notoginseng в почве, загрязненной Cd, под действием экзогенной извести и щавелевой кислоты, а также поиск способов повышения качества и эффективности лекарственного препарата Panax notoginseng. Данное исследование предоставляет ценные рекомендации по увеличению масштабов выращивания травянистых растений на почвах, загрязненных кадмием, и достижению высококачественного, устойчивого производства, необходимого для фармацевтического рынка.
В полевых условиях в Ланьничжай, уезд Цюбэй, префектура Вэньшань, провинция Юньнань (24°11′ с.ш., 104°3′ в.д., высота 1446 м), был проведен полевой эксперимент с использованием местного сорта женьшеня Вэньшань (Panax notoginseng). Среднегодовая температура составляет 17°C, а среднегодовое количество осадков — 1250 мм. Фоновые значения исследуемой почвы: общий азот (TN) 0,57 г кг⁻¹, общий фосфор (TP) 1,64 г кг⁻¹, общий углерод (TC) 16,31 г кг⁻¹, органическое вещество (OM) 31,86 г кг⁻¹, щелочно-гидролизованный азот (N) 88,82 мг кг⁻¹, свободный фосфор 18,55 мг кг⁻¹, свободный калий 100,37 мг кг⁻¹, общий кадмий 0,3 мг кг⁻¹, pH 5,4.
10 декабря 2017 года на поверхность почвы в каждом опытном участке вносили смесь из 6 мг/кг Cd2+ (CdCl2·2,5H2O) и известь (0, 750, 2250 и 3750 кг/ч/м2) слоем 0–10 см. Каждая обработка повторялась 3 раза. Опытные участки располагались случайным образом, каждый участок занимал площадь 3 м2. Однолетние саженцы Panax notoginseng были пересажены через 15 дней после обработки почвы. При использовании солнцезащитной сетки интенсивность света внутри Panax notoginseng составляла около 18% от нормальной интенсивности естественного света. Выращивание проводилось в соответствии с местными традиционными методами. Перед созреванием Panax notoginseng в 2019 году проводили опрыскивание щавелевой кислотой в виде оксалата натрия. Концентрации щавелевой кислоты составляли 0, 0,1 и 0,2 моль/л соответственно, а для регулирования pH до 5,16 использовали NaOH, чтобы имитировать средний pH раствора, полученного из подстилки. Опрыскивание верхней и нижней поверхностей листьев проводили один раз в неделю в 8:00 утра. После четырех опрыскиваний на 5-й неделе были собраны 3-летние растения Panax notoginseng.
В ноябре 2019 года трехлетние растения Panax notoginseng были собраны в поле и опрысканы щавелевой кислотой. Некоторые образцы трехлетних растений Panax notoginseng, для которых необходимо было измерить физиологический метаболизм и активность ферментов, были помещены в пробирки для заморозки. Образцы были быстро заморожены жидким азотом, а затем перенесены в холодильник при температуре -80°C. Некоторые образцы корней, для которых необходимо было измерить содержание Cd и активного ингредиента на стадии зрелости, были промыты водопроводной водой, высушены при 105°C в течение 30 минут, при постоянной массе при 75°C и измельчены в ступке для хранения.
Взвесьте 0,2 г сухого образца растения, поместите его в колбу Эрленмейера, добавьте 8 мл HNO3 и 2 мл HClO4 и накройте крышкой на ночь. На следующий день используйте изогнутую воронку, помещенную в колбу Эрленмейера, для электротермического разложения до появления белого дыма и прозрачности пищеварительных соков. После охлаждения до комнатной температуры смесь перенесите в мерную колбу объемом 10 мл. Содержание Cd определяли с помощью атомно-абсорбционного спектрометра (Thermo ICE™ 3300 AAS, США). (GB/T 23739-2009).
Взвесьте 0,2 г сухого образца растения, поместите его в пластиковую бутылку объемом 50 мл, добавьте 1 моль/л HCl в 10 мл, закройте крышкой, хорошо встряхивайте в течение 15 часов и отфильтруйте. С помощью пипетки отберите необходимое количество фильтрата, разбавьте его соответствующим образом и добавьте раствор SrCl2, чтобы довести концентрацию Sr2+ до 1 г/л. Содержание Ca измеряли с помощью атомно-абсорбционного спектрометра (Thermo ICE™ 3300 AAS, США).
Для определения содержания малонового диальдегида (МДА), супероксиддисмутазы (СОД), пероксидазы (ПОД) и каталазы (КАТ) используйте соответствующий измерительный набор (DNM-9602, Beijing Prong New Technology Co., Ltd., регистрационный номер продукта: Пекинская фармакопея (точная) 2013 № 2400147).
Взвесьте около 0,05 г образца Panax notoginseng и добавьте антрон-сернокислотный реагент по стенкам пробирки. Встряхивайте пробирку в течение 2-3 секунд для тщательного перемешивания жидкости. Поместите пробирку на штатив для пробирок для проявления окраски в течение 15 минут. Содержание растворимых сахаров определяли методом ультрафиолетово-видимой спектрофотометрии (UV-5800, Shanghai Yuanxi Instrument Co., Ltd., Китай) при длине волны 620 нм.
Взвесить 0,5 г свежего образца Panax notoginseng, измельчить его в гомогенат с 5 мл дистиллированной воды, а затем центрифугировать при 10 000 g в течение 10 минут. Надосадочную жидкость разбавить до фиксированного объема. Использовали метод с применением кумасси бриллиантового синего. Содержание растворимого белка измеряли с помощью ультрафиолетово-видимой спектрофотометрии (UV-5800, Shanghai Yuanxi Instrument Co., Ltd., Китай) при длине волны 595 нм и рассчитывали на основе стандартной кривой бычьего сывороточного альбумина.
Взвесить 0,5 г свежего образца, добавить 5 мл 10% уксусной кислоты, измельчить до гомогената, отфильтровать и разбавить до постоянного объема. Для проявления окраски использовали раствор нингидрина. Содержание свободных аминокислот определяли методом УФ-видимой спектрофотометрии (UV-5800, Shanghai Yuanxi Instrument Co., Ltd., Китай) при 570 нм и рассчитывали на основе стандартной кривой лейцина28.
Взвесить 0,5 г свежего образца, добавить 5 мл 3%-ного раствора сульфосалициловой кислоты, нагревать на водяной бане и встряхивать в течение 10 минут. После охлаждения раствор отфильтровать и довести до постоянного объема. Использовали колориметрический метод с кислым нингидрином. Содержание пролина определяли методом ультрафиолетово-видимой спектрофотометрии (УФ-5800, Shanghai Yuanxi Instrument Co., Ltd., Китай) при длине волны 520 нм и рассчитывали на основе стандартной кривой пролина29.
Содержание сапонинов определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в соответствии с Фармакопеей Китайской Народной Республики (издание 2015 года). Основной принцип высокоэффективной жидкостной хроматографии заключается в использовании жидкости высокого давления в качестве подвижной фазы и применении технологии разделения ультрадисперсных частиц с помощью высокоэффективной колоночной хроматографии к стационарной фазе. Техника проведения исследования следующая:
Условия ВЭЖХ и проверка пригодности системы (таблица 1): В качестве наполнителя используйте силикагель, связанный с октадецилсиланом, в качестве подвижной фазы А — ацетонитрил, а в качестве подвижной фазы В — воду. Проведите градиентное элюирование, как показано в таблице ниже. Детектирование проводится при длине волны 203 нм. Согласно пику R1 суммарных сапонинов Panax notoginseng, число теоретических тарелок должно составлять не менее 4000.
Приготовление стандартного раствора: Точно взвесьте гинзенозид Rg1, гинзенозид Rb1 и нотогинзенозид R1 и добавьте метанол для приготовления смеси, содержащей 0,4 мг гинзенозида Rg1, 0,4 мг гинзенозида Rb1 и 0,1 мг нотогинзенозида R1 на 1 мл раствора.
Приготовление тестового раствора: Взвесить 0,6 г порошка женьшеня Panax и добавить 50 мл метанола. Полученный раствор взвесили (W1) и оставили на ночь. Затем раствор осторожно кипятили на водяной бане при 80°C в течение 2 часов. После охлаждения взвесить полученный раствор и добавить приготовленный метанол к первой массе W1. Затем тщательно встряхнуть и отфильтровать. Фильтрат оставить для анализа.
Точно отберите 10 мкл стандартного раствора и 10 мкл фильтрата и введите их в высокоэффективный жидкостный хроматограф (Thermo HPLC-ultimate 3000, Seymour Fisher Technology Co., Ltd.) для определения содержания сапонина 24.
Калибровочная кривая: измерение смешанного стандартного раствора Rg1, Rb1 и R1. Условия хроматографии те же, что и выше. Калибровочную кривую рассчитывают, откладывая по оси Y измеренную площадь пика, а по оси X — концентрацию сапонина в стандартном растворе. Концентрацию сапонина можно рассчитать, подставив измеренную площадь пика образца в калибровочную кривую.
Взвесьте 0,1 г образца P. notogensings и добавьте 50 мл 70% раствора CH3OH. Ультразвуковую экстракцию проводили в течение 2 часов, после чего центрифугировали при 4000 об/мин в течение 10 минут. Возьмите 1 мл супернатанта и разбавьте его в 12 раз. Содержание флавоноидов определяли с помощью ультрафиолетово-видимой спектрофотометрии (UV-5800, Shanghai Yuanxi Instrument Co., Ltd., Китай) при длине волны 249 нм. Кверцетин является одним из стандартных распространенных веществ8.
Данные были организованы с помощью программного обеспечения Excel 2010. Для проведения дисперсионного анализа данных использовалось статистическое программное обеспечение SPSS 20. Изображения были созданы с помощью Origin Pro 9.1. Вычисленные статистические значения включают среднее значение ± стандартное отклонение. Утверждения о статистической значимости основаны на P < 0,05.
При одинаковой концентрации щавелевой кислоты, распыляемой на листья, содержание кальция в корнях Panax notoginseng значительно увеличивалось с увеличением количества внесенной извести (таблица 2). По сравнению с отсутствием извести, содержание кальция увеличилось на 212% при добавлении 3750 кг/ч/м2 извести без распыления щавелевой кислоты. При одинаковом количестве внесенной извести содержание кальция незначительно увеличивалось с увеличением концентрации распыляемой щавелевой кислоты.
Содержание кадмия (Cd) в корнях колеблется от 0,22 до 0,70 мг кг⁻¹. При одинаковой концентрации щавелевой кислоты в растворе, с увеличением количества добавленной извести, содержание Cd при дозе 2250 кг/ч значительно снижается. По сравнению с контролем, содержание Cd в корнях снизилось на 68,57% после опрыскивания 2250 кг гм⁻² извести и 0,1 моль л⁻¹ щавелевой кислоты. При внесении извести без извести и с дозой 750 кг/ч содержание Cd в корнях Panax notoginseng значительно снижалось с увеличением концентрации щавелевой кислоты в растворе. При внесении 2250 кг/м² и 3750 кг/м² извести содержание Cd в корнях сначала снижалось, а затем увеличивалось с увеличением концентрации щавелевой кислоты. Кроме того, бивариантный анализ показал, что известь оказывает значительное влияние на содержание Ca в корнях Panax notoginseng (F = 82,84**), известь оказывает значительное влияние на содержание Cd в корнях Panax notoginseng (F = 74,99**) и щавелевой кислоты (F = 7,72*).
По мере увеличения количества добавленной извести и концентрации распыляемой щавелевой кислоты содержание МДА значительно снижалось. Существенной разницы в содержании МДА в корнях Panax notoginseng без добавления извести и с добавлением 3750 кг/м2 извести не наблюдалось. При нормах внесения 750 кг/ч/м2 и 2250 кг/ч/м2 содержание извести при обработке 0,2 моль/л щавелевой кислоты снизилось на 58,38% и 40,21% соответственно по сравнению с обработкой без щавелевой кислоты. Самое низкое содержание МДА (7,57 нмоль г-1) наблюдалось при распылении 750 кг гм-2 извести и 0,2 моль л-1 щавелевой кислоты (рис. 1).
Влияние внекорневой подкормки щавелевой кислотой на содержание малонового диальдегида в корнях Panax notoginseng в условиях кадмиевого стресса. Примечание: Легенда на рисунке указывает концентрацию щавелевой кислоты в месте опрыскивания (моль/л), разные строчные буквы указывают на существенные различия между вариантами обработки при одинаковом внесении извести. Число (P < 0,05). Аналогично ниже.
За исключением внесения 3750 кг/ч извести, существенной разницы в активности СОД в корнях Panax notoginseng не наблюдалось. При добавлении 0, 750 и 2250 кг/ч/м2 извести активность СОД при обработке опрыскиванием щавелевой кислотой в концентрации 0,2 моль/л была значительно выше, чем без использования щавелевой кислоты, увеличившись на 177,89%, 61,62% и 45,08% соответственно. Активность СОД в корнях (598,18 Ед г-1) была самой высокой в ​​отсутствие внесения извести и при обработке опрыскиванием щавелевой кислотой в концентрации 0,2 моль/л. При опрыскивании щавелевой кислотой в той же концентрации или 0,1 моль/л активность СОД увеличивалась с увеличением количества добавленной извести. После опрыскивания щавелевой кислотой в концентрации 0,2 моль/л активность СОД значительно снижалась (рис. 2).
Влияние опрыскивания листьев щавелевой кислотой на активность супероксиддисмутазы, пероксидазы и каталазы в корнях Panax notoginseng в условиях кадмиевого стресса
Подобно активности СОД в корнях, активность ПОД в корнях, обработанных без извести и опрысканных щавелевой кислотой в концентрации 0,2 моль/л, была самой высокой (63,33 мкмоль/г), что на 148,35% выше, чем в контроле (25,50 мкмоль/г). С увеличением концентрации щавелевой кислоты и обработки известью в количестве 3750 кг/м2 активность ПОД сначала увеличивалась, а затем уменьшалась. По сравнению с обработкой щавелевой кислотой в концентрации 0,1 моль/л, активность ПОД при обработке щавелевой кислотой в концентрации 0,2 моль/л снизилась на 36,31% (рис. 2).
За исключением опрыскивания щавелевой кислотой в концентрации 0,2 моль/л и добавления извести в количестве 2250 кг/ч/м2 или 3750 кг/ч/м2, активность КАТ была значительно выше, чем в контроле. При опрыскивании щавелевой кислотой в концентрации 0,1 моль/л и добавлении извести в количестве 0,2250 кг/м2 или 3750 кг/ч/м2 активность КАТ увеличилась на 276,08%, 276,69% ​​и 33,05% соответственно по сравнению с обработкой без опрыскивания щавелевой кислотой. Активность КАТ в корнях была самой высокой (803,52 мкмоль/г) в варианте без извести и в варианте с щавелевой кислотой в концентрации 0,2 моль/л. Активность КАТ была самой низкой (172,88 мкмоль/г) при обработке 3750 кг/ч/м извести и 0,2 моль/л щавелевой кислоты (рис. 2).
Бивариантный анализ показал, что активность КАТ и активность МДА в корнях Panax notoginseng были значительно связаны с количеством распыленной щавелевой кислоты или извести и двумя вариантами обработки (таблица 3). Активность СОД в корнях была значительно связана с обработкой известью и щавелевой кислотой или концентрацией распыленной щавелевой кислоты. Активность ПОД в корнях значительно зависела от количества внесенной извести или от обработки известью и щавелевой кислотой.
Содержание растворимых сахаров в корнях снижалось с увеличением количества внесенной извести и концентрации щавелевой кислоты в растворе. Не было существенной разницы в содержании растворимых сахаров в корнях Panax notoginseng без внесения извести и при внесении 750 кг/ч/м² извести. При внесении 2250 кг/м² извести содержание растворимых сахаров при обработке 0,2 моль/л щавелевой кислотой было значительно выше, чем при обработке без внесения щавелевой кислоты, увеличившись на 22,81%. При внесении 3750 кг/ч/м² извести содержание растворимых сахаров значительно снижалось с увеличением концентрации вносимой щавелевой кислоты. Содержание растворимых сахаров при обработке 0,2 моль/л щавелевой кислотой снизилось на 38,77% по сравнению с обработкой без внесения щавелевой кислоты. Кроме того, обработка распылением щавелевой кислоты с концентрацией 0,2 моль·л⁻¹ показала самое низкое содержание растворимых сахаров, которое составило 205,80 мг·г⁻¹ (рис. 3).
Влияние внекорневой обработки щавелевой кислотой на содержание растворимых сахаров и растворимых белков в корнях Panax notoginseng в условиях кадмиевого стресса
Содержание растворимого белка в корнях снижалось с увеличением количества внесенной извести и обработки щавелевой кислотой. Без добавления извести содержание растворимого белка при обработке щавелевой кислотой в концентрации 0,2 моль/л значительно снизилось на 16,20% по сравнению с контролем. При внесении 750 кг/ч извести существенных различий в содержании растворимого белка в корнях Panax notoginseng не наблюдалось. При внесении 2250 кг/ч/м² извести содержание растворимого белка при обработке щавелевой кислотой в концентрации 0,2 моль/л было значительно выше, чем при обработке без щавелевой кислоты (35,11%). При внесении 3750 кг·ч/м2 извести содержание растворимого белка значительно снижалось с увеличением концентрации щавелевой кислоты в растворе, при этом самое низкое содержание растворимого белка (269,84 мкг·г⁻¹) наблюдалось при концентрации щавелевой кислоты 0,2 моль·л⁻¹ (рис. 3).
В отсутствие внесения извести существенных различий в содержании свободных аминокислот в корнях Panax notoginseng не наблюдалось. По мере увеличения концентрации щавелевой кислоты при опрыскивании и добавления 750 кг/ч/м2 извести содержание свободных аминокислот сначала уменьшалось, а затем увеличивалось. По сравнению с обработкой без опрыскивания щавелевой кислотой, содержание свободных аминокислот значительно увеличилось на 33,58% при опрыскивании 2250 кг/ч/м2 извести и 0,2 моль/л щавелевой кислоты. Содержание свободных аминокислот значительно уменьшилось с увеличением концентрации щавелевой кислоты при опрыскивании и добавлением 3750 кг/м2 извести. Содержание свободных аминокислот при обработке 0,2 моль/л щавелевой кислоты снизилось на 49,76% по сравнению с обработкой без щавелевой кислоты. Наибольшее содержание свободных аминокислот наблюдалось без опрыскивания щавелевой кислотой и составило 2,09 мг/г. Обработка раствором щавелевой кислоты концентрацией 0,2 моль/л показала самое низкое содержание свободных аминокислот (1,05 мг/г) (рис. 4).
Влияние опрыскивания листьев щавелевой кислотой на содержание свободных аминокислот и пролина в корнях Panax notoginseng в условиях кадмиевого стресса.
Содержание пролина в корнях снижалось с увеличением количества внесенной извести и количества опрыскивания щавелевой кислотой. При отсутствии внесения извести существенных различий в содержании пролина в корнях женьшеня Panax не наблюдалось. По мере увеличения концентрации щавелевой кислоты при опрыскивании и внесения 750 или 2250 кг/м2 извести содержание пролина сначала снижалось, а затем увеличивалось. Содержание пролина при обработке 0,2 моль/л щавелевой кислотой было значительно выше, чем при обработке 0,1 моль/л щавелевой кислотой, увеличившись на 19,52% и 44,33% соответственно. При добавлении 3750 кг/м2 извести содержание пролина значительно снижалось с увеличением концентрации опрыскиваемой щавелевой кислоты. После опрыскивания 0,2 моль/л щавелевой кислотой содержание пролина снизилось на 54,68% по сравнению с вариантом без опрыскивания щавелевой кислотой. Самое низкое содержание пролина было обнаружено при обработке щавелевой кислотой в концентрации 0,2 моль/л и составило 11,37 мкг/г (рис. 4).
Общее содержание сапонинов в Panax notoginseng составляет Rg1>Rb1>R1. Не было обнаружено существенной разницы в содержании трех сапонинов при увеличении концентрации раствора щавелевой кислоты и концентрации без внесения извести (таблица 4).
Содержание R1 после опрыскивания щавелевой кислотой в концентрации 0,2 моль/л было значительно ниже, чем без опрыскивания щавелевой кислотой и при внесении извести в дозе 750 или 3750 кг/м2. При концентрации опрыскиваемой щавелевой кислоты 0 или 0,1 моль/л не наблюдалось существенной разницы в содержании R1 с увеличением количества добавленной извести. При концентрации опрыскивания щавелевой кислотой 0,2 моль/л содержание R1 в 3750 кг/ч/м2 извести было значительно ниже, чем 43,84% без добавления извести (таблица 4).
По мере увеличения концентрации щавелевой кислоты в растворе и добавления 750 кг/м2 извести, содержание Rg1 сначала увеличивалось, а затем уменьшалось. При нормах внесения извести 2250 и 3750 кг/ч содержание Rg1 уменьшалось с увеличением концентрации щавелевой кислоты в растворе. При одинаковой концентрации щавелевой кислоты в растворе, по мере увеличения количества извести, содержание Rg1 сначала увеличивалось, а затем уменьшалось. По сравнению с контролем, за исключением содержания Rg1 в трех концентрациях щавелевой кислоты и при обработке известью 750 кг/м2, которое было выше, чем в контроле, содержание Rg1 в корнях Panax notoginseng в других вариантах обработки было ниже, чем в контроле. Максимальное содержание Rg1 было достигнуто при опрыскивании известью в концентрации 750 кг/ч/м2 и 0,1 моль/л щавелевой кислоты, что на 11,54% выше, чем в контроле (Таблица 4).
При увеличении концентрации щавелевой кислоты в растворе и количества внесенной извести при расходе 2250 кг/ч содержание Rb1 сначала увеличивалось, а затем уменьшалось. После обработки 0,1 моль/л щавелевой кислоты содержание Rb1 достигло максимального значения 3,46%, что на 74,75% выше, чем без обработки щавелевой кислотой. Для других вариантов обработки известью существенных различий между различными концентрациями щавелевой кислоты не наблюдалось. После обработки 0,1 и 0,2 моль/л щавелевой кислоты с увеличением количества извести содержание Rb1 сначала уменьшалось, а затем уменьшалось (таблица 4).
При одинаковой концентрации щавелевой кислоты в растворе для опрыскивания, с увеличением количества добавленной извести, содержание флавоноидов сначала увеличивалось, а затем уменьшалось. При опрыскивании щавелевой кислотой различной концентрации без извести и с добавлением 3750 кг/м2 извести существенной разницы в содержании флавоноидов не наблюдалось. При добавлении 750 и 2250 кг/м2 извести, с увеличением концентрации опрыскиваемой щавелевой кислоты, содержание флавоноидов сначала увеличивалось, а затем уменьшалось. При внесении 750 кг/м2 и опрыскивании щавелевой кислотой в концентрации 0,1 моль/л содержание флавоноидов достигло максимума – 4,38 мг/г, что на 18,38% выше, чем при добавлении того же количества извести, и необходимость в опрыскивании щавелевой кислотой отпала. Содержание флавоноидов при обработке щавелевой кислотой в концентрации 0,1 моль/л увеличилось на 21,74% по сравнению с обработкой без щавелевой кислоты и обработкой известью в дозе 2250 кг/м2 (рис. 5).
Влияние опрыскивания листьев оксалатом на содержание флавоноидов в корне Panax notoginseng в условиях кадмиевого стресса
Бивариантный анализ показал, что содержание растворимых сахаров в корнях Panax notoginseng значительно зависело от количества внесенной извести и концентрации распыляемой щавелевой кислоты. Содержание растворимого белка в корнях значительно коррелировало с дозировкой извести и щавелевой кислоты. Содержание свободных аминокислот и пролина в корнях значительно коррелировало с количеством внесенной извести, концентрацией распыляемой щавелевой кислоты, известью и щавелевой кислотой (таблица 5).
Содержание R1 в корнях Panax notoginseng значительно зависело от концентрации распыляемой щавелевой кислоты, количества извести, извести и щавелевой кислоты. Содержание флавоноидов значительно зависело от концентрации распыляемой щавелевой кислоты и количества добавленной извести.
Для снижения уровня кадмия в растениях путем его фиксации в почве используются различные добавки, такие как известь и щавелевая кислота30. Известь широко используется в качестве почвенной добавки для снижения уровня кадмия в сельскохозяйственных культурах31. Лян и др.32 сообщили, что щавелевая кислота также может использоваться для очистки почвы, загрязненной тяжелыми металлами. После добавления различных концентраций щавелевой кислоты в загрязненную почву содержание органического вещества в почве увеличилось, емкость катионного обмена уменьшилась, а pH повысился33. Щавелевая кислота также может реагировать с ионами металлов в почве. В условиях кадмиевого стресса содержание Cd в Panax notoginseng значительно увеличилось по сравнению с контролем. Однако при использовании извести оно значительно снижается. При внесении 750 кг/ч/м² извести в данном исследовании содержание Cd в корнях достигло национального стандарта (предел Cd ≤ 0,5 мг/кг, AQSIQ, GB/T 19086-200834), и эффект был хорошим. Наилучший эффект достигается при добавлении 2250 кг/м² извести. Добавление извести создает большое количество конкурентных участков для Ca²⁺ и Cd²⁺ в почве, а добавление щавелевой кислоты снижает содержание Cd в корнях Panax notoginseng. После смешивания извести и щавелевой кислоты содержание Cd в корнях Panax ginseng значительно снизилось и достигло национального стандарта. Ca²⁺ в почве адсорбируется на поверхности корней посредством массового потока и может поглощаться клетками корней через кальциевые каналы (Ca²⁺-каналы), кальциевые насосы (Ca²⁺-АТФаза) и Ca²⁺/H⁺-антипортеры, а затем транспортироваться горизонтально к корням. Xylem23. Была обнаружена значительная отрицательная корреляция между содержанием Ca и Cd в корнях (P < 0,05). Содержание Cd уменьшалось с увеличением содержания Ca, что согласуется с идеей антагонизма между Ca и Cd. Дисперсионный анализ показал, что количество извести оказывало значительное влияние на содержание Ca в корне Panax notoginseng. Понграк и др. 35 сообщили, что Cd связывается с оксалатом в кристаллах оксалата кальция и конкурирует с Ca. Однако регулирующее воздействие щавелевой кислоты на Ca было незначительным. Это показывает, что осаждение оксалата кальция из щавелевой кислоты и Ca2+ не является простым осаждением, и процесс соосаждения может контролироваться несколькими метаболическими путями.
При воздействии кадмия в растениях образуется большое количество активных форм кислорода (АФК), повреждающих структуру клеточных мембран36. Содержание малонового диальдегида (МДА) может использоваться в качестве индикатора для оценки уровня АФК и степени повреждения плазматической мембраны растений37. Антиоксидантная система является важным защитным механизмом для нейтрализации активных форм кислорода38. Активность антиоксидантных ферментов (включая ПОД, СОД и КАТ) обычно изменяется под воздействием кадмия. Результаты показали, что содержание МДА положительно коррелирует с концентрацией Cd, указывая на то, что степень перекисного окисления липидов растительных мембран увеличивается с повышением концентрации Cd37. Это согласуется с результатами исследования Оуяна и др.39. Данное исследование показывает, что на содержание МДА существенно влияют известь, щавелевая кислота, известь и щавелевая кислота. После распыления 0,1 моль/л щавелевой кислоты содержание МДА в Panax notoginseng снизилось, что указывает на то, что щавелевая кислота может снижать биодоступность Cd и уровни АФК в Panax notoginseng. Антиоксидантная ферментная система является местом, где происходит детоксикационная функция растения. СОД удаляет O2-, содержащийся в растительных клетках, и производит нетоксичный O2 и малотоксичный H2O2. ПОД и КАТ удаляют H2O2 из растительных тканей и катализируют разложение H2O2 на H2O. На основе протеомного анализа iTRAQ было установлено, что уровни экспрессии белков СОД и PAL снижались, а уровень экспрессии ПОД повышался после применения извести в условиях стресса Cd40. Активность КАТ, СОД и ПОД в корне Panax notoginseng значительно зависела от дозировки щавелевой кислоты и извести. Обработка опрыскиванием щавелевой кислотой в концентрации 0,1 моль/л значительно повысила активность СОД и КАТ, но регулирующее воздействие на активность ПОД было неочевидным. Это показывает, что щавелевая кислота ускоряет разложение АФК в условиях стресса, вызванного кадмием, и в основном завершает удаление H2O2 путем регулирования активности КАТ, что аналогично результатам исследования Го и др.41 по антиоксидантным ферментам Pseudospermum sibiricum. Kos. ). Влияние добавления 750 кг/ч/м2 извести на активность ферментов антиоксидантной системы и содержание малонового диальдегида аналогично эффекту опрыскивания щавелевой кислотой. Результаты показали, что обработка опрыскиванием щавелевой кислотой может более эффективно повысить активность СОД и КАТ в Panax notoginseng и повысить стрессоустойчивость Panax notoginseng. Активность СОД и ПОД снижалась при обработке щавелевой кислотой в концентрации 0,2 моль/л и известью в количестве 3750 кг/га, что указывает на то, что чрезмерное опрыскивание высокими концентрациями щавелевой кислоты и Ca2+ может вызывать стресс у растений, что согласуется с исследованиями Ло и др. Уэйт 42.