Спасибо за посещение сайта nature.com. В используемой вами версии браузера поддержка CSS ограничена. Для наилучшего результата мы рекомендуем использовать последнюю версию браузера (или отключить режим совместимости в Internet Explorer). Кроме того, для обеспечения дальнейшей поддержки, на этом сайте не будут использоваться стили и JavaScript.
Сероводород (H2S) оказывает множество физиологических и патологических воздействий на организм человека. Гидросульфид натрия (NaHS) широко используется в качестве фармакологического инструмента для оценки воздействия H2S в биологических экспериментах. Хотя потеря H2S из растворов NaHS занимает всего несколько минут, растворы NaHS использовались в качестве доноров H2S в питьевой воде в некоторых исследованиях на животных. В данном исследовании изучалось, может ли питьевая вода с концентрацией NaHS 30 мкМ, приготовленная в бутылках для крыс/мышей, оставаться стабильной в течение как минимум 12–24 часов, как предполагают некоторые авторы. Раствор NaHS (30 мкМ) готовили в питьевой воде и немедленно разливали его в бутылки для крыс/мышей. Пробы отбирали с кончика и внутренней поверхности бутылки через 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 и 24 часа для измерения содержания сульфида с использованием метода метиленового синего. Кроме того, самцам и самкам крыс в течение двух недель вводили NaHS (30 мкМ), а концентрацию сульфида в сыворотке измеряли через день в течение первой недели и в конце второй недели. Раствор NaHS в образце, полученном из кончика бутылки с водой, был нестабилен; его концентрация снизилась на 72% и 75% через 12 и 24 часа соответственно. В образцах, полученных изнутри бутылок с водой, снижение концентрации NaHS было незначительным в течение 2 часов; однако через 12 и 24 часа оно снизилось на 47% и 72% соответственно. Инъекция NaHS не повлияла на уровень сульфида в сыворотке крови у самцов и самок крыс. В заключение, растворы NaHS, приготовленные из питьевой воды, не следует использовать для введения H2S, поскольку раствор нестабилен. Этот способ введения будет подвергать животных воздействию нерегулярных и меньших, чем ожидалось, количеств NaHS.
Сероводород (H2S) используется в качестве токсина с 1700 года; однако его возможная роль в качестве эндогенной молекулы биосигнализации была описана Абе и Кимурой в 1996 году. За последние три десятилетия были выявлены многочисленные функции H2S в различных системах человека, что привело к пониманию того, что молекулы-доноры H2S могут иметь клиническое применение в лечении или контроле некоторых заболеваний; см. обзор Чирино и др.
Гидросульфид натрия (NaHS) широко используется в качестве фармакологического инструмента для оценки воздействия H2S во многих исследованиях клеточных культур и на животных5,6,7,8. Однако NaHS не является идеальным донором H2S, поскольку он быстро превращается в H2S/HS- в растворе, легко загрязняется полисульфидами, легко окисляется и улетучивается4,9. Во многих биологических экспериментах NaHS растворяют в воде, что приводит к пассивному улетучиванию и потере H2S10,11,12, спонтанному окислению H2S11,12,13 и фотолизу14. Сульфид в исходном растворе очень быстро теряется из-за улетучивания H2S11. В открытом контейнере период полураспада (t1/2) H2S составляет около 5 минут, а его концентрация снижается примерно на 13% в минуту10. Хотя потеря сероводорода из растворов NaHS занимает всего несколько минут, в некоторых исследованиях на животных растворы NaHS использовались в качестве источника сероводорода в питьевой воде в течение 1–21 недели, при этом раствор, содержащий NaHS, заменялся каждые 12–24 часа.15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 Такая практика не соответствует принципам научных исследований, поскольку дозировка лекарственных препаратов должна основываться на их применении у других видов животных, особенно у человека.27
Доклинические исследования в биомедицине направлены на улучшение качества медицинской помощи пациентам или результатов лечения. Однако результаты большинства исследований на животных еще не были перенесены на людей28,29,30. Одной из причин этой неудачи является недостаточное внимание к методологическому качеству исследований на животных30. Поэтому целью данного исследования было выяснить, могут ли 30 мкМ растворы NaHS, приготовленные в бутылках с водой для крыс/мышей, оставаться стабильными в питьевой воде в течение 12–24 часов, как утверждается или предполагается в некоторых исследованиях.
Все эксперименты в данном исследовании проводились в соответствии с опубликованными руководящими принципами по уходу и использованию лабораторных животных в Иране31. Все экспериментальные отчеты в этом исследовании также соответствовали рекомендациям ARRIVE32. Комитет по этике Института эндокринных наук Медицинского университета им. Шахида Бехешти одобрил все экспериментальные процедуры в данном исследовании.
Дигидрат ацетата цинка (CAS: 5970-45-6) и безводный хлорид железа (CAS: 7705-08-0) были приобретены у компании Biochem, Chemopahrama (Косн-сюр-Луар, Франция). Гидрат гидросульфида натрия (CAS: 207683-19-0) и N,N-диметил-п-фенилендиамин (DMPD) (CAS: 535-47-0) были приобретены у компании Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США). Изофлуран был приобретен у компании Piramal (Бетлехем, Пенсильвания, США). Соляная кислота (HCl) была приобретена у компании Merck (Дармштадт, Германия).
Приготовьте раствор NaHS (30 мкМ) в питьевой воде и немедленно разлейте его в поилки для крыс/мышей. Эта концентрация была выбрана на основе многочисленных публикаций, в которых NaHS использовался в качестве источника H2S; см. раздел «Обсуждение». NaHS — это гидратированная молекула, которая может содержать различное количество гидратационной воды (т. е., NaHS•xH2O); по данным производителя, процентное содержание NaHS, использованного в нашем исследовании, составляло 70,7% (т. е., NaHS•1,3 H2O), и мы учли это значение в наших расчетах, где мы использовали молекулярную массу 56,06 г/моль, что соответствует молекулярной массе безводного NaHS. Гидратационная вода (также называемая кристаллизационной водой) — это молекулы воды, составляющие кристаллическую структуру33. Гидраты обладают иными физическими и термодинамическими свойствами по сравнению с безводными соединениями34.
Перед добавлением NaHS в питьевую воду измерьте pH и температуру растворителя. Немедленно перелейте раствор NaHS в поилку для крыс/мышей в клетке. Пробы отбирали с кончика и изнутри поилки через 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 и 24 часа для измерения содержания сульфидов. Измерения содержания сульфидов проводили сразу после каждого отбора проб. Мы брали пробы с кончика трубки, поскольку некоторые исследования показали, что малый размер пор трубки может минимизировать испарение H2S15,19. По-видимому, это относится и к раствору в самой поилке. Однако это не относилось к раствору в горлышке поилки, который имел более высокую скорость испарения и подвергался автоокислению; фактически, животные пили эту воду первой.
В исследовании использовались самцы и самки крыс породы Вистар. Крысы содержались в полипропиленовых клетках (2–3 крысы в ​​клетке) в стандартных условиях (температура 21–26 °C, влажность 32–40%) при 12-часовом световом дне (с 7:00 до 19:00) и 12-часовом темном дне (с 19:00 до 7:00). Крысы имели свободный доступ к водопроводной воде и получали стандартный корм (компания Khorak Dam Pars, Тегеран, Иран). 10 самок (n=10, масса тела: 190–230 г) и 10 самцов (n=10, масса тела: 320–370 г) крыс породы Вистар одного возраста (6 месяцев) были случайным образом разделены на контрольную группу и группу, получавшую NaHS (30 мкМ) (n=5 в каждой группе). Для определения размера выборки мы использовали подход KISS (Keep It Simple, Stupid – «Делай проще, глупый»), который сочетает в себе предыдущий опыт и анализ мощности35. Сначала мы провели пилотное исследование на 3 крысах и определили средний уровень общего сульфида в сыворотке и стандартное отклонение (8,1 ± 0,81 мкМ). Затем, учитывая мощность 80% и предполагая двусторонний уровень значимости 5%, мы определили предварительный размер выборки (n = 5 на основе предыдущих исследований), который соответствовал стандартизированному размеру эффекта 2,02 с предопределенным значением, предложенным Фестингом для расчета размера выборки экспериментальных животных35. После умножения этого значения на стандартное отклонение (2,02 × 0,81) прогнозируемый обнаруживаемый размер эффекта (1,6 мкМ) составил 20%, что является приемлемым. Это означает, что n = 5/группа достаточно для обнаружения 20% изменения среднего значения между группами. Крысы были случайным образом разделены на контрольную группу и группу, получавшую NaSH, с использованием функции случайного выбора в программе Excel36 (дополнительный рисунок 1). На уровне результатов было обеспечено ослепление исследователей, проводивших биохимические измерения, и они не знали о распределении участников по группам.
Группы крыс обоих полов, получавших NaHS, в течение 2 недель обрабатывали 30 мкМ раствором NaHS, приготовленным в питьевой воде; свежий раствор предоставляли каждые 24 часа, в течение которых измеряли массу тела. Образцы крови отбирали из кончиков хвостов всех крыс под изофлурановой анестезией через день в конце первой и второй недель. Образцы крови центрифугировали при 3000 g в течение 10 мин, сыворотку отделяли и хранили при –80°C для последующего измерения уровня мочевины, креатинина (Cr) и общего сульфида в сыворотке. Мочевину в сыворотке определяли ферментативным уреазным методом, а креатинин в сыворотке — фотометрическим методом Яффе с использованием коммерчески доступных наборов (компания Man, Тегеран, Иран) и автоматического анализатора (Selectra E, серийный номер 0-2124, Нидерланды). Внутри- и межаналитические коэффициенты вариации для мочевины и Cr составляли менее 2,5%.
Метод метиленового синего (МБ) используется для измерения общего содержания сульфидов в питьевой воде и сыворотке, содержащей NaHS; МБ является наиболее часто используемым методом для измерения сульфидов в растворах и биологических образцах11,37. Метод МБ может быть использован для оценки общего пула сульфидов38 и измерения неорганических сульфидов в виде H2S, HS- и S2 в водной фазе39. В этом методе сера осаждается в виде сульфида цинка (ZnS) в присутствии ацетата цинка11,38. Осаждение ацетатом цинка является наиболее широко используемым методом для отделения сульфидов от других хромофоров11. ZnS повторно растворяли с использованием HCl11 в сильнокислых условиях. Сульфид реагирует с ДМПД в стехиометрическом соотношении 1:2 в реакции, катализируемой хлоридом железа (Fe3+ действует как окислитель), с образованием красителя МБ, который детектируется спектрофотометрически при 670 нм40,41. Предел обнаружения метода МБ составляет приблизительно 1 мкМ11.
В данном исследовании в пробирку добавляли 100 мкл каждого образца (раствора или сыворотки); затем добавляли 200 мкл ацетата цинка (1% масс./об. в дистиллированной воде), 100 мкл DMPD (20 мМ в 7,2 М HCl) и 133 мкл FeCl3 (30 мМ в 1,2 М HCl). Смесь инкубировали при 37°C в темноте в течение 30 мин. Раствор центрифугировали при 10 000 g в течение 10 мин, и абсорбцию супернатанта измеряли при 670 нм с помощью микропланшетного ридера (BioTek, MQX2000R2, Winooski, VT, USA). Концентрации сульфидов определяли с помощью калибровочной кривой NaHS (0–100 мкМ) в дистиллированной воде (дополнительный рисунок 2). Все растворы, использованные для измерений, были приготовлены непосредственно перед применением. Внутри- и межаналитические коэффициенты вариации для измерений сульфидов составили 2,8% и 3,4% соответственно. Мы также определили общее количество сульфидов, извлеченных из образцов питьевой воды и сыворотки, содержащих тиосульфат натрия, с использованием метода обогащенных образцов42. Степень извлечения для образцов питьевой воды и сыворотки, содержащих тиосульфат натрия, составила 91 ± 1,1% (n = 6) и 93 ± 2,4% (n = 6) соответственно.
Статистический анализ проводился с использованием программного обеспечения GraphPad Prism версии 8.0.2 для Windows (GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния, США, www.graphpad.com). Для сравнения температуры и pH питьевой воды до и после добавления NaHS использовался парный t-тест. Потеря H2S в растворе, содержащем NaHS, рассчитывалась как процентное снижение от исходного уровня поглощения, а для оценки статистической значимости потери проводился однофакторный дисперсионный анализ с повторными измерениями, за которым следовал множественный сравнительный тест Даннетта. Масса тела, уровень мочевины в сыворотке, уровень креатинина в сыворотке и общий уровень сульфидов в сыворотке с течением времени сравнивались между контрольными и обработанными NaHS крысами разного пола с использованием двухфакторного смешанного (между-внутри) дисперсионного анализа, за которым следовал апостериорный тест Бонферрони. Двусторонние значения P < 0,05 считались статистически значимыми.
Значение pH питьевой воды составляло 7,60 ± 0,01 до добавления NaHS и 7,71 ± 0,03 после добавления NaHS (n = 13, p = 0,0029). Температура питьевой воды составляла 26,5 ± 0,2 и снизилась до 26,2 ± 0,2 после добавления NaHS (n = 13, p = 0,0128). Приготовьте 30 мкМ раствор NaHS в питьевой воде и храните его в бутылке. Раствор NaHS нестабилен, и его концентрация со временем снижается. При отборе проб из горлышка бутылки наблюдалось значительное снижение (68,0%) в течение первого часа, а содержание NaHS в растворе снизилось на 72% и 75% через 12 и 24 часа соответственно. В образцах, полученных из бутылок с водой, снижение концентрации NaHS было незначительным в течение первых 2 часов, но через 12 и 24 часа оно уменьшилось на 47% и 72% соответственно. Эти данные показывают, что процентное содержание NaHS в 30 мкМ растворе, приготовленном в питьевой воде, снизилось примерно до четверти от исходного значения через 24 часа, независимо от места отбора проб (Рисунок 1).
Стабильность раствора NaHS (30 мкМ) в питьевой воде в бутылках для крыс/мышей. После приготовления раствора отбирали образцы с кончика и внутренней части бутылки. Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение (n = 6/группа). * и #, P < 0,05 по сравнению с моментом времени 0. На фотографии показан кончик бутылки (с отверстием) и корпус бутылки. Объем кончика составляет приблизительно 740 мкл.
Концентрация NaHS в свежеприготовленном 30 мкМ растворе составляла 30,3 ± 0,4 мкМ (диапазон: 28,7–31,9 мкМ, n = 12). Однако через 24 часа концентрация NaHS снизилась до более низкого значения (среднее: 3,0 ± 0,6 мкМ). Как показано на рисунке 2, концентрации NaHS, воздействию которых подвергались крысы, не оставались постоянными в течение периода исследования.
Масса тела самок крыс значительно увеличилась с течением времени (с 205,2 ± 5,2 г до 213,8 ​​± 7,0 г в контрольной группе и с 204,0 ± 8,6 г до 211,8 ± 7,5 г в группе, получавшей NaHS); однако лечение NaHS не оказало влияния на массу тела (рис. 3). Масса тела самцов крыс значительно увеличилась с течением времени (с 338,6 ± 8,3 г до 352,4 ± 6,0 г в контрольной группе и с 352,4 ± 5,9 г до 363,2 ± 4,3 г в группе, получавшей NaHS); однако лечение NaHS не оказало влияния на массу тела (рис. 3).
Изменения массы тела у самок и самцов крыс после введения NaHS (30 мкМ). Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего и сравнивались с использованием двухфакторного смешанного (внутригруппового и межгруппового) дисперсионного анализа с последующим тестом Бонферрони. n = 5 особей каждого пола в каждой группе.
Концентрации мочевины и креатинфосфата в сыворотке крови были сопоставимы у контрольных крыс и крыс, получавших NaSH, на протяжении всего исследования. Кроме того, лечение NaSH не повлияло на концентрации мочевины и креатинхрома в сыворотке крови (таблица 1).
Исходные концентрации общего сульфида в сыворотке крови были сопоставимы у контрольных и обработанных NaHS самцов (8,1 ± 0,5 мкМ против 9,3 ± 0,2 мкМ) и самок (9,1 ± 1,0 мкМ против 6,1 ± 1,1 мкМ) крыс. Введение NaHS в течение 14 дней не оказало влияния на уровни общего сульфида в сыворотке крови ни у самцов, ни у самок крыс (рис. 4).
Изменения общей концентрации сульфидов в сыворотке крови у самцов и самок крыс после введения NaHS (30 мкМ). Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего и сравнивались с использованием двухфакторного смешанного (внутригруппового) дисперсионного анализа с последующим тестом Бонферрони. Для каждого пола n = 5/группа.
Главный вывод этого исследования заключается в том, что питьевая вода, содержащая NaHS, нестабильна: через 24 часа после отбора проб из кончика и внутренней части бутылок с водой для крыс/мышей можно обнаружить лишь около четверти от первоначального общего содержания сульфидов. Кроме того, крысы подвергались воздействию нестабильных концентраций NaHS из-за потери H2S в растворе NaHS, и добавление NaHS в питьевую воду не влияло на массу тела, уровень мочевины и креатинина в сыворотке крови, а также на общее содержание сульфидов в сыворотке.
В данном исследовании скорость потери H2S из 30 мкМ растворов NaHS, приготовленных в питьевой воде, составляла приблизительно 3% в час. В буферном растворе (100 мкМ сульфида натрия в 10 мМ PBS, pH 7,4) концентрация сульфида, как сообщалось, снижалась на 7% в течение 8 часов11. Ранее мы обосновывали внутрибрюшинное введение NaHS, сообщая, что скорость потери сульфида из 54 мкМ раствора NaHS в питьевой воде составляла приблизительно 2,3% в час (4%/час в первые 12 часов и 1,4%/час в последние 12 часов после приготовления)8. Более ранние исследования43 выявили постоянную потерю H2S из растворов NaHS, главным образом из-за испарения и окисления. Даже без добавления пузырьков сульфид в исходном растворе быстро теряется из-за испарения H2S11. Исследования показали, что в процессе разбавления, который занимает около 30–60 секунд, около 5–10% H2S теряется из-за испарения⁶. Для предотвращения испарения H2S из раствора исследователи приняли ряд мер, включая осторожное перемешивание раствора¹², покрытие исходного раствора полиэтиленовой пленкой⁶ и минимизацию воздействия воздуха на раствор, поскольку скорость испарения H2S зависит от границы раздела воздух-жидкость¹³. Самопроизвольное окисление H2S происходит главным образом за счет ионов переходных металлов, особенно трехвалентного железа, которые являются примесями в воде¹³. Окисление H2S приводит к образованию полисульфидов (атомов серы, связанных ковалентными связями)¹¹. Чтобы избежать окисления, растворы, содержащие H2S, готовят в деоксигенированных растворителях44,45, а затем продувают аргоном или азотом в течение 20–30 мин для обеспечения деоксигенации11,12,37,44,45,46. Диэтилентриаминпентауксусная кислота (ДТПА) является хелатором металлов (10–4 М), предотвращающим автоокисление HS- в аэробных растворах. В отсутствие ДТПА скорость автоокисления HS- составляет приблизительно 50% примерно за 3 часа при 25°C37,47. Кроме того, поскольку окисление 1e-сульфида катализируется ультрафиолетовым светом, раствор следует хранить на льду и защищать от света11.
Как показано на рисунке 5, NaHS диссоциирует на Na+ и HS-6 при растворении в воде; эта диссоциация определяется pK1 реакции, которая зависит от температуры: pK1 = 3,122 + 1132/T, где T варьируется от 5 до 30°C и измеряется в градусах Кельвина (K), K = °C + 273,1548. HS- имеет высокое значение pK2 (pK2 = 19), поэтому при pH < 96,49 S2- не образуется или образуется в очень малых количествах. В отличие от этого, HS- действует как основание и принимает H+ от молекулы H2O, а H2O действует как кислота и превращается в H2S и OH-.
Образование растворенного газа H2S в растворе NaHS (30 мкМ). aq — водный раствор; g — газ; l — жидкость. Все расчеты предполагают, что pH воды = 7,0 и температура воды = 20 °C. Создано с помощью BioRender.com.
Несмотря на данные о нестабильности растворов NaHS, в нескольких исследованиях на животных растворы NaHS в питьевой воде использовались в качестве донора H2S15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, а продолжительность экспериментов варьировалась от 1 до 21 недели (Таблица 2). В ходе этих исследований раствор NaHS обновлялся каждые 12 ч, 15, 17, 18, 24, 25 ч или 24 ч, 19, 20, 21, 22, 23 ч. Наши результаты показали, что крысы подвергались воздействию нестабильных концентраций препарата из-за потери H2S из раствора NaHS, а содержание NaHS в питьевой воде крыс значительно колебалось в течение 12 или 24 часов (см. Рисунок 2). В двух из этих исследований сообщалось, что уровни H2S в воде оставались стабильными в течение 24 часов22 или что за 12 часов наблюдались потери H2S всего на 2–3%15, но они не предоставили подтверждающих данных или подробностей измерений. Два исследования показали, что малый диаметр бутылок с водой может минимизировать испарение H2S15,19. Однако наши результаты показали, что это может лишь отсрочить потерю H2S из бутылки с водой на 2 часа, а не на 12–24 часа. В обоих исследованиях отмечается, что мы предполагаем, что уровень NaHS в питьевой воде не изменился, поскольку мы не наблюдали изменения цвета воды; следовательно, окисление H2S воздухом было незначительным19,20. Удивительно, но этот субъективный метод оценивает стабильность NaHS в воде, а не измеряет изменение его концентрации с течением времени.
Потеря H2S в растворе NaHS связана с pH и температурой. Как отмечено в нашем исследовании, растворение NaHS в воде приводит к образованию щелочного раствора50. При растворении NaHS в воде образование растворенного газообразного H2S зависит от значения pH6. Чем ниже pH раствора, тем больше доля NaHS, присутствующая в виде молекул газообразного H2S, и тем больше сульфида теряется из водного раствора11. Ни в одном из этих исследований не сообщалось о pH питьевой воды, используемой в качестве растворителя для NaHS. Согласно рекомендациям ВОЗ, принятым большинством стран, pH питьевой воды должен находиться в диапазоне 6,5–8,551. В этом диапазоне pH скорость спонтанного окисления H2S увеличивается примерно в десять раз13. Растворение NaHS в воде в этом диапазоне pH приведет к концентрации растворенного газообразного H2S от 1 до 22,5 мкМ, что подчеркивает важность контроля pH воды перед растворением NaHS. Кроме того, температурный диапазон, указанный в вышеупомянутом исследовании (18–26 °C), приведет к изменению концентрации растворенного H2S в растворе примерно на 10%, поскольку изменения температуры изменяют pK1, а небольшие изменения pK1 могут оказать существенное влияние на концентрацию растворенного H2S48. Также длительная продолжительность некоторых исследований (5 месяцев)22, в течение которых ожидается значительная изменчивость температуры, усугубляет эту проблему.
Во всех исследованиях, кроме одного21, использовался раствор NaHS концентрацией 30 мкМ в питьевой воде. Для объяснения используемой дозы (т.е. 30 мкМ) некоторые авторы указывали на то, что NaHS в водной фазе производит точно такую ​​же концентрацию газообразного H2S, и что физиологический диапазон H2S составляет от 10 до 100 мкМ, поэтому эта доза находится в пределах физиологического диапазона15,16. Другие объясняли, что 30 мкМ NaHS может поддерживать уровень H2S в плазме в пределах физиологического диапазона, т.е. 5–300 мкМ19,20. Мы рассматриваем концентрацию NaHS в воде 30 мкМ (pH = 7,0, T = 20 °C), которая использовалась в некоторых исследованиях для изучения влияния H2S. Мы можем рассчитать, что концентрация растворенного газообразного H2S составляет 14,7 мкМ, что составляет около 50% от исходной концентрации NaHS. Это значение аналогично значению, рассчитанному другими авторами в тех же условиях13,48.
В нашем исследовании введение NaHS не изменило массу тела; этот результат согласуется с результатами других исследований на самцах мышей22,23 и самцах крыс18; однако в двух исследованиях сообщалось, что NaSH восстановил сниженную массу тела у крыс после нефрэктомии24,26, тогда как в других исследованиях не сообщалось о влиянии введения NaSH на массу тела15,16,17,19,20,21,25. Кроме того, в нашем исследовании введение NaSH не повлияло на уровни мочевины и креатинина в сыворотке крови, что согласуется с результатами другого исследования25.
Исследование показало, что добавление NaHS в питьевую воду в течение 2 недель не повлияло на общую концентрацию сульфида в сыворотке крови у самцов и самок крыс. Этот вывод согласуется с результатами исследования Сена и др. (16): 8 недель лечения 30 мкМ NaHS в питьевой воде не повлияли на уровень сульфида в плазме крови у контрольных крыс; однако они сообщили, что это вмешательство восстановило сниженный уровень H2S в плазме крови у мышей после нефрэктомии. Ли и др. (22) также сообщили, что лечение 30 мкМ NaHS в питьевой воде в течение 5 месяцев увеличило уровень свободного сульфида в плазме крови у старых мышей примерно на 26%. В других исследованиях не сообщалось об изменениях уровня циркулирующего сульфида после добавления NaHS в питьевую воду.
В семи исследованиях сообщалось об использовании Sigma NaHS15,16,19,20,21,22,23, но не приводились дополнительные сведения о воде гидратации, а в пяти исследованиях не упоминался источник NaHS, используемый в методах приготовления17,18,24,25,26. NaHS — это гидратированная молекула, и содержание воды гидратации в ней может варьироваться, что влияет на количество NaHS, необходимое для приготовления раствора заданной молярности. Например, содержание NaHS в нашем исследовании составляло NaHS•1,3 H2O. Таким образом, фактические концентрации NaHS в этих исследованиях могут быть ниже, чем указанные.
«Как такое недолговечное соединение может оказывать столь длительное воздействие?» — задали этот вопрос Позгай и др.21, оценивая влияние NaHS на колит у мышей. Они надеются, что будущие исследования смогут ответить на этот вопрос, и предполагают, что растворы NaHS могут содержать более стабильные полисульфиды в дополнение к H2S и дисульфидам, которые опосредуют действие NaHS21. Другая возможность заключается в том, что очень низкие концентрации NaHS, остающиеся в растворе, также могут оказывать благотворное воздействие. В самом деле, Олсон и др. предоставили доказательства того, что микромолярные уровни H2S в крови не являются физиологическими и должны находиться в наномолярном диапазоне или вовсе отсутствовать13. H2S может действовать посредством сульфатирования белков, обратимой посттрансляционной модификации, которая влияет на функцию, стабильность и локализацию многих белков52,53,54. Фактически, в физиологических условиях примерно от 10% до 25% многих белков печени сульфилированы53. В обоих исследованиях признается быстрое разрушение NaHS19,23, но, что удивительно, утверждается, что «мы контролировали концентрацию NaHS в питьевой воде, заменяя его ежедневно».23 В одном исследовании случайно было заявлено, что «NaHS является стандартным донором H2S и обычно используется в клинической практике для замены самого H2S».18
Приведенное выше обсуждение показывает, что NaHS теряется из раствора в результате испарения, окисления и фотолиза, поэтому предлагаются некоторые способы уменьшения потерь H2S из раствора. Во-первых, испарение H2S зависит от границы раздела газ-жидкость13 и pH раствора11; поэтому, чтобы минимизировать потери от испарения, горлышко бутылки с водой можно сделать как можно уже, как описано ранее15,19, а pH воды можно отрегулировать до приемлемого верхнего предела (т.е., 6,5–8,551), чтобы минимизировать потери от испарения11. Во-вторых, спонтанное окисление H2S происходит из-за воздействия кислорода и присутствия ионов переходных металлов в питьевой воде13, поэтому деоксигенация питьевой воды аргоном или азотом44,45 и использование хелаторов металлов37,47 могут уменьшить окисление сульфидов. В-третьих, чтобы предотвратить фоторазложение H2S, бутылки с водой можно обернуть алюминиевой фольгой; Эта практика также применима к светочувствительным материалам, таким как стрептозоцин55. Наконец, неорганические сульфидные соли (NaHS, Na2S и CaS) можно вводить перорально, а не растворять в питьевой воде, как сообщалось ранее56,57,58; исследования показали, что радиоактивный сульфид натрия, вводимый перорально крысам, хорошо абсорбируется и распределяется практически во всех тканях59. На сегодняшний день в большинстве исследований неорганические сульфидные соли вводились внутрибрюшинно; однако этот путь редко используется в клинической практике60. С другой стороны, пероральный путь является наиболее распространенным и предпочтительным путем введения у людей61. Поэтому мы рекомендуем оценить эффекты доноров H2S у грызунов путем перорального введения.
Ограничением является то, что мы измеряли сульфид в водном растворе и сыворотке с использованием метода МБ. Методы измерения сульфида включают титрование йодом, спектрофотометрию, электрохимический метод (потенциометрия, амперометрия, кулонометрический метод и амперометрический метод) и хроматографию (газовая хроматография и высокоэффективная жидкостная хроматография), среди которых наиболее часто используется спектрофотометрический метод МБ62. Ограничением метода МБ для измерения H2S в биологических образцах является то, что он измеряет все серосодержащие соединения, а не свободный H2S63, поскольку он проводится в кислых условиях, что приводит к извлечению серы из биологического источника64. Однако, согласно Американской ассоциации общественного здравоохранения, метод МБ является стандартным методом измерения сульфида в воде65. Поэтому это ограничение не влияет на наши основные результаты, касающиеся нестабильности растворов, содержащих NaHS. Кроме того, в нашем исследовании степень извлечения сульфида из образцов воды и сыворотки, содержащих NaHS, составила 91% и 93% соответственно. Эти значения соответствуют ранее сообщенным диапазонам (77–92)66, что указывает на приемлемую аналитическую точность42. Стоит отметить, что мы использовали как самцов, так и самок крыс в соответствии с рекомендациями Национальных институтов здравоохранения (NIH), чтобы избежать чрезмерной опоры на исследования только самцов в доклинических исследованиях67 и включать в исследования как самцов, так и самок крыс, когда это возможно68. Этот момент подчеркивался и другими исследователями69,70,71.
В заключение, результаты данного исследования показывают, что растворы NaHS, приготовленные из питьевой воды, не могут быть использованы для получения H2S из-за их нестабильности. Такой способ введения подвергнет животных воздействию нестабильных и более низких, чем ожидалось, уровней NaHS; следовательно, полученные результаты могут быть неприменимы к людям.
Использованные и/или проанализированные в ходе данного исследования наборы данных доступны у соответствующего автора по обоснованному запросу.
Сабо, К. Хронология исследований сероводорода (H2S): от экологического токсина до биологического медиатора. Биохимия и фармакология 149, 5–19. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2017.09.010 (2018).
Абе, К. и Кимура, Х. Возможная роль сероводорода как эндогенного нейромодулятора. Журнал нейронаук, 16, 1066–1071. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.16-03-01066.1996 (1996).
Чирино, Г., Сабо, К. и Папапетропулос, А. Физиологическая роль сероводорода в клетках, тканях и органах млекопитающих. Обзоры по физиологии и молекулярной биологии 103, 31–276. https://doi.org/10.1152/physrev.00028.2021 (2023).
Диллон, К.М., Карраццоне, Р.Дж., Мэтсон, Дж.Б., и Кашфи, К. Развивающиеся перспективы клеточных систем доставки оксида азота и сероводорода: новая эра персонализированной медицины. Биохимия и фармакология 176, 113931. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2020.113931 (2020).
Сунь, Х. и др. Длительное применение донора сероводорода с замедленным высвобождением может предотвратить ишемически-реперфузионное повреждение миокарда. Научные отчеты 7, 3541. https://doi.org/10.1038/s41598-017-03941-0 (2017).
Ситдикова, Г.Ф., Фукс, Р., Кайнц, В., Вайгер, Т.М. и Германн, А. Фосфорилирование BK-канала регулирует чувствительность к сероводороду (H2S). Frontiers in Physiology 5, 431. https://doi.org/10.3389/fphys.2014.00431 (2014).
Ситдикова, Г.Ф., Вайгер, Т.М. и Германн, А. Сероводород усиливает активность кальций-активируемых калиевых (БК) каналов в клетках опухоли гипофиза крысы. Archit. Pfluegers. 459, 389–397. https://doi.org/10.1007/s00424-009-0737-0 (2010).
Джедди, С. и др. Сероводород усиливает защитный эффект нитрита против ишемически-реперфузионного повреждения миокарда у крыс с диабетом 2 типа. Оксид азота 124, 15–23. https://doi.org/10.1016/j.niox.2022.04.004 (2022).
Корвино, А. и др. Тенденции в химии доноров H2S и их влияние на сердечно-сосудистые заболевания. Антиоксиданты 10, 429. https://doi.org/10.3390/antiox10030429 (2021).
ДеЛеон, Э.Р., Стой, Г.Ф., и Олсон, К.Р. (2012). Пассивные потери сероводорода в биологических экспериментах. Аналитическая биохимия 421, 203–207. https://doi.org/10.1016/j.ab.2011.10.016 (2012).
Надь, П. и др. Химические аспекты измерения сероводорода в физиологических образцах. Biochimica et Biophysical Acta 1840, 876–891. https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2013.05.037 (2014).
Клайн, Л.Л.Д. Спектрофотометрическое определение сероводорода в природных водах. Limnol. Oceanogr. 14, 454–458. https://doi.org/10.4319/lo.1969.14.3.0454 (1969).
Олсон, К. Р. (2012). Практическое обучение химии и биологии сероводорода. «Антиоксиданты». Редокс-сигнализация. 17, 32–44. https://doi.org/10.1089/ars.2011.4401 (2012).