Сортировка белков в секреторном пути имеет важное значение для поддержания компартментализации клеток и гомеостаза. Помимо сортировки, опосредованной оболочкой, роль липидов в сортировке кинезинов в процессе секреторного транспорта является давним фундаментальным вопросом, на который до сих пор нет ответа. В данном исследовании мы проводим трехмерную одновременную многоцветную визуализацию высокого разрешения в реальном времени, чтобы доказать in vivo, что вновь синтезированные гликозилфосфатидилинозитол-иммобилизованные белки с очень длинными церамидными липидными фрагментами кластеризуются и классифицируются в специализированные места выхода из эндоплазматической сети, отличающиеся от тех, которые используются трансмембранными белками. Кроме того, мы показываем, что длина цепи церамида в мембране эндоплазматического ретикулума имеет решающее значение для этой селективности сортировки. Наше исследование предоставляет первые прямые доказательства in vivo классификации белковых грузов на основе длины липидной цепи в селективные места экспорта в секреторном пути.
В эукариотических клетках белки, синтезированные в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР), затем сортируются во время транспорта по секреторному пути для доставки в соответствующее клеточное место назначения (1). Помимо сортировки, опосредованной оболочкой, долгое время предполагалось, что определенные липиды также могут служить селективными точками выхода, группируя их в специфические мембранные домены, которые связывают определенные белки (2-5). Однако до сих пор отсутствуют прямые доказательства in vivo, подтверждающие этот возможный липидный механизм. Чтобы решить эту основную проблему, мы изучили на дрожжах, как гликозилфосфатидилинозитол (GPI)-якорные белки (GPI-AP) дифференцированно экспортируются из ЭР. GPI-AP представляют собой различные липид-связанные белки клеточной поверхности (6, 7). GPI-AP — это секретируемый белок, прикрепленный к наружным слоям плазматической мембраны через гликолипидную часть (GPI-якорь). Они принимают GPI-якоря в качестве консервативных посттрансляционных модификаций в просвете ЭР (8). После прикрепления GPI-AP проходит через аппарат Гольджи (5, 9) из ЭР к плазматической мембране. Наличие GPI-якорей приводит к тому, что GPI-AP транспортируется отдельно от трансмембранных секретируемых белков (включая другие белки плазматической мембраны) по секреторному пути (5, 9, 10). В дрожжевых клетках GPI-AP отделяются от других секретируемых белков в эндоплазматическом ретикулуме, а затем упаковываются в уникальные везикулы, обернутые комплексом белков оболочки II (COPII) (6, 7). Факторы, определяющие этот процесс классификации в процессе экспорта из ЭР, неясны, но предполагается, что этот механизм может требовать липидов, особенно структурной перестройки липидной части GPI-якоря (5, 8). У дрожжей липидная перестройка GPI начинается сразу после прикрепления GPI и во многих случаях приводит к связыванию церамида с 26-углеродной длинноцепочечной насыщенной жирной кислотой (C26:0) (11, 12). Церамид C26 является основным церамидом, продуцируемым дрожжевыми клетками на сегодняшний день. Он синтезируется в ЭР, и большая его часть экспортируется в аппарат Гольджи через везикулы COPII (13). Экспорт GPI-AP из ЭР требует непрерывного синтеза церамида (14, 15), а в свою очередь, превращение церамида в инозитолфосфат церамид (IPC) в аппарате Гольджи зависит от синтеза GPI-якоря (16). Биофизические исследования с использованием искусственных мембран показали, что церамиды с очень длинными ацильными цепями могут сливаться, образуя упорядоченные домены с уникальными физическими свойствами (17, 18). Эти данные приводят к гипотезе о том, что церамид C26 и GPI-AP с церамидом C26 используют свои физические свойства для слияния в упорядоченные области или области в относительно хаотичной липидной среде мембраны ЭР. Он в основном состоит из коротких и ненасыщенных глицеролипидов (C16:1 и C18:1) (19, 20). Эти регионы будут избирательно сфокусированы на определенных местах выхода из ЭР (ERES), где церамид и основанный на церамиде GPI-AP могут совместно транспортироваться в аппарат Гольджи в одной и той же специализированной везикуле COPII (5).
В данном исследовании мы непосредственно проверили этот липидный механизм с помощью конфокальной микроскопии сверхвысокого разрешения в реальном времени (SCLIM), которая является передовой микроскопической техникой, позволяющей одновременно наблюдать флуоресцентно меченые белки. Трехцветные и трехмерные (3D) изображения обладают чрезвычайно высоким разрешением и скоростью в живых клетках (21, 22).
Сначала мы применили технологию SCLIM для дальнейшего определения того, как нормальный GPI-AP с церамидной группой C26 отфильтровывается из трансмембранных секретируемых белков после выхода из ЭР в S. cerevisiae. Для проверки классификации ЭР мы использовали генетическую систему, которая позволяет непосредственно визуализировать вновь синтезированный груз, поступающий в ЭРЭ in vivo (7, 23). В качестве груза мы выбрали GPI-AP Gas1 на основе церамида C26, меченный зеленым флуоресцентным белком (GFP), и трансмембранный секретируемый белок Mid2, меченный ближнеинфракрасным флуоресцентным белком (iRFP), оба из которых нацелены на плазматическую мембрану (24–26). В термочувствительном мутанте sec31-1 эти два груза экспрессируются под галактозо-индуцируемым промотором и конститутивным маркером ЭРЭ. При экстремальной температуре (37°C), поскольку мутация sec31-1 влияет на функцию компонента оболочки COPII Sec31, ингибируя прорастание COPII и экспорт из ЭР, вновь синтезированный груз накапливается в ЭР (23). После охлаждения до низкой температуры (24°C) клетки мутанта sec31-1 восстанавливаются из секреторной зоны, и накопленный новый синтезированный груз начинает экспортироваться из ЭР. Визуализация CLIM показала, что большая часть вновь синтезированных Gas1-GFP и Mid2-iRFP все еще накапливается в ЭР клеток мутанта sec31-1 после инкубации при 37°C, а затем высвобождается при 24°C в течение 5 минут (Рисунок 1). Поскольку Mid2-iRFP распределяется по всей мембране ЭР, а Gas1-GFP концентрируется и собирается в области прерывистой мембраны ЭР, их распределение совершенно различно (Рисунок 1, A-C и Видео S1). Кроме того, как показано на рисунке 1D, кластер Gas1-GFP не содержит Mid2-iRFP. Эти результаты указывают на то, что GPI-AP и трансмембранные белки были разделены на разные области мембраны ЭР на ранней стадии. Кластер Gas1-GFP находится рядом со специфическим ERES, помеченным белком оболочки COPII Sec13 mCherry (рисунок 1, E и F, и видео S1) (23).
Клетки sec31-1 экспрессируют секреты, индуцированные галактозой, церамид с длинной ацильной цепью (C26) GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, зеленый) и трансмембранный белок Mid2-iRFP (TMP, синий), а также конструктивную метку ERES Sec13-mCherry (ERES, пурпурный). Клетки инкубировали при 37°C в течение 30 минут, затем переносили в условия 24°C и визуализировали с помощью SCLIM через 5 минут. (A-C) показывают репрезентативное объединенное или единое 2D-изображение плоскости (A), 2D-проекционное изображение 10 z-срезов (B) или 3D-изображение клеточной полусферы с грузом и маркерами ERES (C). Масштабная линейка 1 мкм (A и B). Единица масштаба 0,551 мкм (C). Gas1-GFP был обнаружен в дискретных областях или кластерах ЭР, тогда как Mid2-iRFP был обнаружен и распределен по всей мембране ЭР (C). (D) График показывает относительную интенсивность флуоресценции Gas1-GFP и Mid2-iRFP в кластере Gas1-GFP вдоль белой стрелки (слева). AU, условная единица. (E и F) представляют собой 3D-изображение, объединяющее товар и метку ЭР. Кластеры Gas1-GFP были обнаружены вблизи специфической области ЭР. Масштабная единица составляет 0,551 мкм. (F) Белая сплошная стрелка указывает на кластер Gas1-GFP, связанный с ЭР. На среднем и правом панелях показано объединенное увеличенное 3D-изображение и повернутый вид выбранного кластера Gas1-GFP.
Тесная пространственная взаимосвязь между кластером Gas1-GFP и конкретным ERES указывает на то, что Gas1-GFP может проникать в селективные ERES, что отличается от селективности, используемой Mid2-iRFP для выхода из ЭР. Чтобы проверить эту возможность, мы количественно оценили соотношение ERES только для одного или двух грузов (рис. 2, A-C). Мы обнаружили, что большинство ERES (70%) содержат только один тип груза. На нижнем изображении рис. 2C показаны два типичных примера ERES только с Gas1-GFP (рис. 1) или только с Mid2-iRFP (рис. 2). В отличие от этого, приблизительно 20% ERES содержат два груза, которые перекрываются в одной и той же области. Было обнаружено, что некоторые ERES (10%) содержат два типа груза, но они изолированы в явно разных областях. Таким образом, этот статистический анализ показывает, что после экспорта из ЭР GPI-AP Gas1-GFP и трансмембранный груз Mid2-iRFP разделяются на разные ERES (рис. 2D). Эффективность сортировки очень хорошо согласуется с предыдущим биохимическим анализом (6) и морфологическим определением (7). Мы также можем наблюдать поведение карантинного груза, поступающего в ERES (рисунок 2E и видео S2). На рисунке 2E показано, что только небольшая часть Gas1-GFP (панель 3) или Mid2-iRFP (панель 4) поступает в ERES с одной стороны и ограничивается дискретной областью. На панели 5 рисунка 2E показано, что Gas1-GFP и Mid2-iRFP иногда обнаруживаются в одном и том же ERES, но они поступают с разных сторон и концентрируются в отдельных областях, которые могут представлять собой разные везикулы COPII. Мы также подтвердили, что наблюдаемое разделение и классификация Gas1 на основе церамида C26 GPI-AP как селективного ERES является специфическим, поскольку другой трансмембранный секреторный груз, меченый GFP белок плазматической мембраны Axl2 (27), демонстрирует аналогичное поведение, как и Mid2-iRFP (рисунок S1 и видео S3). Вновь синтезированный Axl2-GFP распределяется по мембране ЭР подобно Mid2-iRFP (рисунок S1, A и B) и ко-локализуется с Mid2-iRFP в большинстве ERES (рисунок S1, B-D). На панелях 1 и 2 рисунка 1. S1C показаны два типичных примера ERES, где два трансмембранных груза перекрываются. В этих случаях оба груза попадают в ERES одновременно (рисунок S1E, панель 3 и видео S3).
Клетки sec31-1, экспрессирующие индуцируемые галактозой секреты Gas1-GFP (GPI-AP, зеленый) и Mid2-iRFP (TMP, синий), а также конститутивную метку ERES Sec13-mCherry (ERES, пурпурный), помещали при температуре 37 °C. После инкубации в течение 30 минут при °C клетки перемещали в условия 24 °C для снятия блока секреции и проводили визуализацию с помощью SCLIM через 20 минут. (A-C) Репрезентативные 2D проекционные изображения (A; масштабная линейка, 1 мкм) или 3D изображения полусфер клеток (B и C; масштабная единица, 0,456 мкм) содержимого и 10 z-срезов, отмеченных ERES. Нижняя панель в (B) и панель в (C) отображают обработанные изображения, показывающие только содержимое, присутствующее в ERES (пурпурный) [Gas1-GFP (серый) и Mid2-iRFP (светло-голубой)]. (C) Открытая стрелка: ERES содержит только один фрагмент груза (от 1 до 4). Серая стрелка: ERES содержит разделенный груз (5). Белая сплошная стрелка: ERES содержит совместно локализованный груз. Ниже: Выбранный отдельный ERES содержит только Gas1-GFP (1) или Mid2-iRFP (2). Масштабная линейка, 100 нм. (D) Количественная оценка микрофотографии, описанной в (C). Средний процент ERES, содержащих только один груз (Gas1-GFP или Mid2-iRFP), разделенный груз и перекрывающийся груз. В трех независимых экспериментах n=432 в 54 клетках. Погрешность = стандартное отклонение. Двусторонний непарный t-тест. *** P = 0,0002. (E) 3D-изображение выбранного ERES карантинированного груза, отмеченного (C). Gas1-GFP (зеленый) (3) или Mid2-iRFP (синий) (4) входит в ERES (пурпурный) с одной стороны и ограничен небольшой областью внутри ERES. Иногда оба типа груза попадают в один и тот же ERES (5) с одной и той же стороны и оказываются в изолированной зоне внутри ERES. Масштабная линейка, 100 нм.
Далее мы проверили гипотезу о том, что церамид с длинной ацильной цепью (C26), присутствующий в мембране ЭР, определяет специфическую кластеризацию и сортировку Gas1 в селективные ЭРЭ. Для этого мы использовали модифицированный штамм дрожжей GhLag1, в котором две эндогенные церамидсинтазы Lag1 и Lac1 были заменены на GhLag1 (гомолог Lag1 хлопка), в результате чего был получен штамм дрожжей с клеточной мембраной, содержащей церамиды короче, чем у дикого типа (рис. 3А) (28). Масс-спектрометрический анализ (МС) показал, что в штаммах дикого типа 95% всего церамида составляет церамид с очень длинной цепью (C26), тогда как в GhLag1 85% церамида составляет церамид с очень длинной цепью (C18 и C16), и только 2% церамида составляет церамид с очень длинной цепью (C26). Хотя C18 и C16 церамиды являются основными церамидами, обнаруженными в мембране GhLag1 до настоящего времени, анализ MS также подтвердил, что GPI-якорь Gas1-GFP, экспрессируемый в штамме GhLag1, содержит C26 церамид, который сопоставим с липидами дикого типа. Качество одинаково (рис. 3A) (26). Следовательно, это означает, что фермент ремоделирования церамида Cwh43 обладает высокой селективностью к C26 церамиду, как показано на рисунке 26, он преимущественно включает GPI-якорь из небольшого количества C26 церамида в штамме GhLag1. S2 (29). Тем не менее, клеточная мембрана GhLag1 в основном содержит только C18-C16 церамид, в то время как Gas1-GFP все еще содержит C26 церамид. Этот факт делает этот штамм идеальным инструментом для специфического решения проблемы длины ацильной цепи мембранного церамида в ЭР. Гипотетическая роль класса и сортировки. Затем мы сначала изучили способность C26 Gas1-GFP накапливаться в кластерах в GhLag1 с термочувствительным мутантным аллелем sec31-1 с помощью обычной флуоресцентной микроскопии, где в мембране ЭР присутствует только длинная цепь (C18-C16) церамида (рис. 3). Мы наблюдали, что в sec31-1 большая часть Gas1-GFP концентрировалась в кластерах, в то время как Gas1-GFP в sec31-1 GhLag1 с длинной (C18-C16) цепью церамида в мембране ЭР в основном не образовывал кластеров и распределялся по всей мембране ЭР. Точнее говоря, поскольку кластеризация на основе церамида C26 тесно связана со специфическими ERES (рис. 1), мы далее исследовали, может ли этот процесс также включать функцию механизма экспорта белков из ЭР. GPI-AP использует специальную систему COPII для экспорта из ЭР, которая активно регулируется структурной перестройкой гликозидной части GPI-якоря ферментом Ted1 (30, 31). Рекомбинантный GPI-гликан затем распознается трансмембранным рецептором груза p24, который, в свою очередь, избирательно рекрутирует Lst1, являющийся специфической изоформой основной субъединицы COPII, связывающей груз Sec24, образуя богатые GPI-AP везикулы COPII (31-33). Поэтому мы сконструировали двойной мутант, сочетающий делецию этих отдельных белков (компонента комплекса p24 Emp24, фермента перестройки GPI-гликана Ted1 и специфической субъединицы COPII Lst1) со штаммом мутанта sec31-1, и изучили возможность образования кластера Gas1 GFP (рисунок 3). Мы обнаружили, что в sec31-1emp24Δ и sec31-1ted1Δ Gas1-GFP в основном некластеризован и распределен по всей мембране ЭР, как это было ранее показано в sec31-1 GhLag1, тогда как в sec31-1lst1Δ Gas1-GFP аналогичен sec31-1. Эти результаты указывают на то, что помимо присутствия церамида C26 в мембране ЭР, кластеризация Gas1-GFP также требует связывания с комплексом p24 и не требует специфического привлечения Lst1. Затем мы исследовали возможность того, что длина цепи церамида в мембране ЭР может регулировать связывание Gas1-GFP с p24. Однако мы обнаружили, что присутствие церамида C18-C16 в мембране не влияет на GPI-гликаны, реконструированные комплексом p24 (рисунки S3 и S4, A и B), или на связывание с GPI-AP и экспорт GPI-AP. Рекрутирование субтипа COPII Lst1 (рисунок S4C). Следовательно, кластеризация, зависящая от церамида C26, не требует белковых взаимодействий с различными механизмами экспорта белков ЭР, но поддерживает альтернативный механизм сортировки, определяемый длиной липидов. Затем мы проанализировали, важна ли длина ацильной цепи церамида в мембране ЭР для эффективной классификации Gas1-GFP как селективного ERES. Поскольку Gas1 в штамме GhLag1 с короткоцепочечным церамидом покидает ЭР и попадает в плазматическую мембрану (рисунок S5), мы считаем, что если сортировка определяется длиной ацильной цепи церамида, то Gas1 в штамме GhLag1 может быть перенаправлен и пересечен с товарами ERES, находящимися на той же мембране.
(A) Клеточная мембрана GhLag1 в основном содержит более короткие церамиды C18-C16, в то время как GPI-якорь Gas1-GFP по-прежнему имеет тот же C26 IPC, что и клетки дикого типа. Вверху: анализ длины ацильной цепи церамида в клеточной мембране штаммов дикого типа (Wt) и GhLag1p методом масс-спектрометрии (МС). Данные представляют собой процент от общего количества церамида. Среднее значение трех независимых экспериментов. Погрешность = стандартное отклонение. Двусторонний непарный t-тест. **** P < 0,0001. Внизу: МС-анализ длины ацильной цепи IPC, присутствующей в GPI-якоре Gas1-GFP (GPI-IPC), экспрессируемом в штаммах дикого типа и GhLag1p. Данные представляют собой процент от общего сигнала IPC. Среднее значение пяти независимых экспериментов. Погрешность = стандартное отклонение. Двусторонний непарный t-тест. ns, не имеет значения. P = 0,9134. (B) Флуоресцентные микрофотографии клеток sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ и sec31-1lst1Δ, экспрессирующих Gas1-GFP, индуцированный галактозой, инкубировали при 37°C в течение 30 минут, а затем переносили на среду для проведения стандартной флуоресцентной микроскопии после 24°C. Белая стрелка: кластер Gas1-GFP в ЭР. Открытая стрелка: некластеризованный Gas1-GFP распределен по всей мембране ЭР, демонстрируя характерное для ЭР ядерное кольцевое окрашивание. Масштабная линейка, 5 мкм. (C) Количественная оценка микрофотографии, описанной в (B). Средний процент клеток с точечной структурой Gas1-GFP. В трех независимых экспериментах n≥300 клеток. Погрешность = стандартное отклонение. Двусторонний непарный t-тест. **** P ＜0.0001.
Для непосредственного решения этой проблемы мы провели SCLIM-визуализацию Gas1-GFP и Mid2-iRFP в GhLag1 с термочувствительным мутантным аллелем sec31-1 (рисунок 4 и видео S4). После того, как ЭР удерживалась при 37°C, а затем высвобождалась при 24°C, большая часть вновь синтезированного Gas1-GFP не кластеризовалась и распределялась по всей мембране ЭР, как это наблюдалось с помощью обычных микроскопов (рисунок 4, A и B). Кроме того, большой процент ERES (67%) включает два типа груза, совместно локализованных в нем (рисунок 4D). Панели 1 и 2 рисунка 4C показывают два типичных примера ERES с перекрывающимися Gas1-GFP и Mid2-GFP. Кроме того, оба груза были рекрутированы в один и тот же ERES (рисунок 4E, панель 3 и видео S4). Таким образом, наши результаты показывают, что длина ацильной цепи церамида в мембране эндоплазматического ретикулума является важным фактором, определяющим агрегацию и классификацию белков эндоплазматического ретикулума.
Клетки Sec31-1 GhLag1, экспрессирующие секреты, индуцированные галактозой, Gas1-GFP (GPI-AP, зеленый) и Mid2-iRFP (TMP, синий), а также конститутивно меченный ERES Sec13-mCherry (ERES, пурпурный). Инкубировать при 37°C. Продолжать в течение 30 минут, затем снизить температуру до 24°C для высвобождения секретов и провести визуализацию с помощью SCLIM через 20 минут. (A-C) Репрезентативные 2D проекционные изображения (A; масштабная линейка, 1 мкм) или 3D изображения полусфер клеток (B и C; масштабная единица, 0,45 мкм) 10 z-срезов, помеченных грузом и ERES. Нижняя панель в (B) и панель в (C) отображают обработанные изображения, показывающие только грузы, присутствующие в ERES (пурпурный) [Gas1-GFP (серый) и Mid2-iRFP (светло-голубой)]. (C) Белая закрашенная стрелка: ERES, товары перекрываются. Открытая стрелка: ERES содержит только один элемент. Нижняя панель: выбранный ERES имеет перекрывающиеся товары (1 и 2), отмеченные на (C). Масштабная линейка, 100 нм. (D) Количественная оценка микрофотографии, описанной на (C). В единицах sec31-1 и sec31-1 GhLag1 содержится только один груз (Gas1-GFP или Mid2-iRFP), и средний процент ERES для изолированного груза и перекрывающегося груза. В трех независимых экспериментах n = 432 в 54 клетках (sec31-1) и n = 430 в 47 клетках (sec31-1 GhLag1). Погрешность = стандартное отклонение. Двусторонний непарный t-тест. *** P = 0,0002 (sec31-1) и ** P = 0,0031 (sec31-1 GhLag1). (E) Трехмерное изображение выбранного ERES с перекрывающимся грузом (3), отмеченным на (C). Gas1-GFP (зеленый) и Mid2-iRFP (синий) приближаются к ERES (пурпурный) с одной стороны и остаются в одной и той же ограниченной области ERES. Масштабная линейка, 100 нм.
Данное исследование предоставляет прямые доказательства in vivo того, что белковые грузы на основе липидов классифицируются по селективным участкам экспорта в секреторном пути, и выявляет важность длины ацильной цепи для селективности классификации. Используя мощную и передовую микроскопическую технику SCLIM, мы продемонстрировали недавно синтезированный Gas1-GFP (основной GPI-AP плазматической мембраны с очень длинной ацильной цепью (C26) церамидного липидного фрагмента) в дрожжах. Области, сгруппированные в дискретные ЭР, связаны со специфическими ЭРЭ, в то время как трансмембранные секретируемые белки распределены по всей мембране ЭР (рис. 1). Кроме того, эти два типа грузов селективно попадают в разные ЭРЭ (рис. 2). Длина ацильной цепи клеточного церамида в мембране уменьшается с C26 до C18-C16, кластер Gas1-GFP разрушается и попадает в дискретную область ЭР, а Gas1-GFP перенаправляется, покидая ЭР вместе с трансмембранным белком через тот же ЭРЭ (рисунок 3 и рисунок 3). 4).
Хотя GPI-AP использует специализированный белковый механизм для выхода из ЭР, мы обнаружили, что разделение, зависящее от церамида C26, не основано на дифференциальных белковых взаимодействиях, которые могут приводить к специализации ERES (рисунки S4 и S5). Вместо этого наши результаты подтверждают альтернативный механизм классификации, основанный на кластеризации белков на основе липидов и последующем исключении других грузов. Наши наблюдения показывают, что в области или кластере Gas1-GFP, связанном со специфическим ERES, отсутствует трансмембранный секретируемый белок Mid2-iRFP, что указывает на то, что кластер GPI-AP, зависящий от церамида C26, будет способствовать их проникновению в соответствующий ERES и одновременно исключать трансмембранные секретируемые белки, попадающие в этот конкретный ERES (рисунки 1 и 2). В отличие от этого, присутствие церамидов C18-C16 в мембране ЭР не приводит к образованию областей или кластеров GPI-AP, поэтому они не исключают и не замещают трансмембранные секретируемые белки в том же ERES (рисунки 3 и 4). Таким образом, мы предполагаем, что церамид C26 способствует разделению и классификации, облегчая кластеризацию белков, связанных со специфическими ERES.
Как добиться кластеризации, зависящей от церамида C26, в определенную область ЭР? Тенденция мембранного церамида к латеральному разделению может привести к образованию небольших и мгновенно упорядоченных липидов из GPI-AP и церамида C26 в более нерегулярной липидной среде мембраны ЭР, содержащей более короткие и ненасыщенные глицеролипиды. Качественные кластеры (17, 18). Эти небольшие временные кластеры могут быть дополнительно объединены в более крупные, более стабильные кластеры после связывания с комплексом p24 (34). В соответствии с этим, мы показали, что C26 Gas1-GFP необходимо взаимодействовать с комплексом p24 для образования более крупных видимых кластеров (рис. 3). Комплекс p24 представляет собой гетерозиготный олигомер, состоящий из четырех различных трансмембранных белков p24 в дрожжах (35), который обеспечивает многовалентное связывание, что может привести к сшиванию небольших кластеров GPI-AP, тем самым генерируя более крупные стабильные кластеры (34). Взаимодействие между эктодоменами белков GPI-AP также может способствовать их агрегации, как показано во время их транспорта в аппарат Гольджи в поляризованных эпителиальных клетках млекопитающих (36). Однако, когда церамид C18-C16 присутствует в мембране ЭР, при связывании комплекса p24 с Gas1-GFP большие отдельные кластеры не образуются. Основной механизм может зависеть от специфических физических и химических свойств церамида с длинной ацильной цепью. Биофизические исследования искусственных мембран показывают, что, хотя как церамиды с длинной (C24), так и с короткой (C18-C16) ацильной цепью могут вызывать фазовое разделение, только церамиды с длинной ацильной цепью (C24) могут способствовать высокой кривизне и изгибу пленки для изменения ее формы. Через взаимную отсылку (17, 37, 38). Было показано, что трансмембранная спираль TMED2, человеческого гомолога Emp24, избирательно взаимодействует со сфингомиелином на основе церамида C18 в цитоплазматических дольках (39). Используя моделирование молекулярной динамики (МД), мы обнаружили, что как церамиды C18, так и C26 накапливаются вокруг цитоплазматических долек трансмембранной спирали Emp24, и они имеют схожие предпочтения (рисунок S6). Стоит отметить, что это указывает на то, что трансмембранная спираль Emp24 может приводить к асимметричному распределению липидов в мембране. Это недавний результат, полученный на клетках млекопитающих. Аналогичные моделирования МД также показывают наличие эфирных липидов (40). Поэтому мы предполагаем, что церамид C26 локально обогащен в двух дольках ER26. Когда GPI-AP в люминальных дольках напрямую связывается с мультивалентным p24 и происходит накопление церамида C26 вокруг p24 в цитоплазматических дольках, это может способствовать сопутствующей агрегации белков и образованию изгиба мембраны посредством пальцев (41), что приводит к разделению GPI-AP на дискретные области, прилегающие к ERES, что также способствует образованию сильно изогнутых областей мембраны ЭР (42). Предыдущие исследования подтвердили предложенный механизм (43, 44). Мультивалентное связывание олиголектинов, патогенов или антител с гликосфинголипидами (GSL) на основе церамида на плазматической мембране вызывает крупную агрегацию GSL, усиливает фазовое разделение и вызывает деформацию мембраны и интернализацию (44). Ивабучи и др. (43) Было обнаружено, что в присутствии длинных (C24), но не коротких (C16) ацильных цепей, многовалентный лиганд, связанный с лактозилцерамидом GSL, индуцировал образование больших кластеров и инвагинацию мембраны, а опосредованная цитоплазматическим Lyn передача сигнала на слоях переплетается ацильными цепями в сопряженных нейтрофилах.
В поляризованных эпителиальных клетках млекопитающих концентрация анти-Гольджи сети (TGN) на уровне апикальной плазматической мембраны контролирует разделение и сортировку GPI-AP (10, 45). Эта агрегация обусловлена ​​олигомеризацией GPI-AP (36), но она также может зависеть от длины цепи церамида, обнаруженной в дрожжах. Хотя GPI-AP млекопитающих имеет якорь на основе эфирного липида, и его химическая структура сильно отличается от очень длинноцепочечного ацильного церамида, недавнее исследование показало, что оба липида имеют эволюционно схожие физические и химические свойства и функции (40). Следовательно, эфирная липидная часть в клетках млекопитающих может быть похожа на C26-церамид в дрожжах, и ее роль заключается в связывании с длинноцепочечным церамидом в мембране для содействия агрегации и сортировке GPI-AP. Хотя эту возможность еще предстоит проверить напрямую, предыдущие исследования подтверждают, что транспорт церамида с длинной ацильной цепью в аппарат Гольджи осуществляется не цитоплазматическими транспортными белками, а зависит от синтеза GPI-якорей, как у дрожжей. Следовательно, эволюционно консервативный механизм, по-видимому, способен избирательно совместно транспортировать церамид с очень длинной ацильной цепью и GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) в одной и той же транспортной везикуле.
В системах поляризованных эпителиальных клеток дрожжей и млекопитающих агрегация GPI-AP и отделение от других белков плазматической мембраны происходят до достижения поверхности клетки. Паладино и др. (48) обнаружили, что на TGN поляризованных эпителиальных клеток млекопитающих кластеризация GPI-AP необходима не только для селективной классификации GPI-AP на апикальной плазматической мембране, но и регулирует организацию кластеризации GPI-AP и их биологическую активность на поверхности клетки. В дрожжах это исследование показало, что зависимая от церамида C26 кластеризация GPI-AP на ЭР может регулировать организацию кластеризации и функциональную активность GPI-AP на плазматической мембране (24, 49). В соответствии с этой моделью, клетки GhLag1 имеют аллергию на ингибиторы GPI или препараты, влияющие на целостность клеточной стенки (28), а необходимость функциональных кластеров Gas1-GFP (49) концевого церамида, проецируемого при спаривании дрожжевых клеток, указывает на возможные физиологические последствия ошибки GPI-AP в клетках hLag1. Однако дальнейшее тестирование того, была ли функциональная организация поверхности клетки запрограммирована из ЭР методом сортировки, основанным на длине липидов, станет предметом наших будущих исследований.
Штаммы Saccharomyces cerevisiae, использованные в данной работе, перечислены в таблице S1. Штаммы MMY1583 и MMY1635 SCLIM для визуализации живых клеток были сконструированы на основе W303. Эти штаммы, экспрессирующие Sec13-mCherry с флуоресцентной белковой меткой, были сконструированы с использованием метода на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) с плазмидой pFA6a в качестве матрицы (23). Штамм, экспрессирующий Mid2-iRFP, меченный флуоресцентным белком под контролем промотора GAL1, был сконструирован следующим образом. Амплификация последовательности iRFP-KanMx методом ПЦР из вектора pKTiRFP-KAN (предоставлен Э. О'Ши, номер плазмиды Addgene 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; идентификатор исследовательского ресурса (RRID): Addgene_64687) была проведена и вставлена ​​в С-конец эндогенного Mid2. После амплификации и клонирования геномной последовательности Mid2-iRFP в промотор GAL1, она была интегрирована в сайт Not I-Sac I интеграционной плазмиды pRS306. Полученная плазмида pRGS7 была линеаризована с помощью Pst I для интеграции в локус URA3.
Ген слияния Gas1-GFP экспрессируется под контролем промотора GAL1 в центромерной (CEN) плазмиде, которая сконструирована следующим образом. Последовательность Gas1-GFP была амплифицирована методом ПЦР из плазмиды pRS416-GAS1-GFP (24) (подарок Л. Пополо) и клонирована в сайт Xma I–Xho I CEN-плазмиды pBEVY-GL LEU2 (подарок С. Миллера; номер плазмиды в Addgene 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). Полученная плазмида была названа pRGS6. Ген слияния Axl2-GFP также экспрессируется под контролем промотора GAL1 вектора pBEVY-GL LEU2, и его конструирование осуществляется следующим образом. Последовательность Axl2-GFP была амплифицирована из плазмиды pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) методом ПЦР и клонирована в сайт Bam HI-Pst I вектора pBEVY-GL LEU2. Полученная плазмида получила название pRGS12. Последовательности олигонуклеотидов, использованных в этом исследовании, приведены в таблице S2.
В качестве источника углерода штамму добавляли 0,2% аденина и 2% глюкозы [YP-декстроза (YPD)], 2% раффинозы [YP-раффиноза], богатый дрожжевым экстрактом белок p (YP) [среда (1% дрожжевого экстракта и 2% белкового пептида (YPR)] или 2% галактозы [YP-галактоза (YPG)], либо синтетическую минимальную среду (0,15% дрожжевой азотистой основы и 0,5% сульфата аммония) для восполнения необходимых аминокислот и оснований для питания, а также 2% глюкозы (синтетическая глюкозная минимальная среда) или 2% галактозы (синтетическая галактозная минимальная среда) в качестве источника углерода.
Для визуализации в реальном времени термочувствительные мутантные клетки sec31-1, экспрессирующие конструкцию под промотором GAL1, выращивали в среде YPR при 24°C в течение ночи до середины логарифмической фазы роста. После индукции в среде YPG при 24°C в течение 1 часа клетки инкубировали в среде SG при 37°C в течение 30 минут, а затем переносили в среду с температурой 24°C для снятия блока секреции. Клетки фиксировали на предметном стекле конканавалином А, а визуализацию проводили методом SCLIM. SCLIM представляет собой комбинацию инвертированного флуоресцентного микроскопа Olympus IX-71 и объектива UPlanSApo с числовой апертурой 100×1,4 (Olympus), высокоскоростного конфокального сканера с вращающимся диском и высоким отношением сигнал/шум (Yokogawa Electric), специализированного спектрометра и специализированной системы охлаждения. Усилитель изображения системы (Hamamatsu Photonics) может обеспечить систему увеличительных линз с конечным увеличением ×266,7 и камеру на основе прибора с зарядовой связью, которая умножает электроны (Hamamatsu Photonics) (21). Получение изображений осуществляется с помощью специализированного программного обеспечения (Yokogawa Electric). Для получения 3D-изображений мы использовали изготовленный на заказ пьезоэлектрический актуатор для вертикальной вибрации объектива и собирали оптические части на расстоянии 100 нм друг от друга в стопку. Изображение Z-стека преобразуется в трехмерные воксельные данные, а теоретическая функция рассеяния точки, используемая для конфокального микроскопа с вращающимся диском, применяется для обработки деконволюции с помощью программного обеспечения Volocity (PerkinElmer). С помощью программного обеспечения Volocity автоматически устанавливается пороговое значение для анализа совместной локализации, измеряется количество ERES, включая груз. Анализ линейного сканирования выполняется с помощью программного обеспечения MetaMorph (Molecular Devices).
Для определения статистической значимости используйте программное обеспечение GraphPad Prism. Для двухстороннего t-критерия Стьюдента и однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) различия между группами считаются значимыми при P < 0,05 (*).
Для флуоресцентной микроскопии Gas1-GFP клетки в логарифмической фазе роста выращивали в течение ночи в среде YPD, собирали центрифугированием, дважды промывали фосфатно-буферным раствором и инкубировали на льду не менее 15 минут, а затем исследовали под микроскопом, как описано ранее в Check (24). Для получения изображений использовали микроскоп Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS), оснащенный объективом, фильтром L5 (GFP), камерой Hamamatsu и программным обеспечением Application Suite X (LAS X).
Образцы денатурировали с помощью буфера для образцов SDS при 65°C в течение 10 минут, а затем разделяли методом электрофореза в полиакриламидном геле (PAGE). Для иммуноблоттинга на каждую дорожку загружали 10 мкл образца. Первичные антитела: использовали кроличьи поликлональные антитела против Gas1 в разведении 1:3000, кроличьи поликлональные антитела против Emp24 в разведении 1:500 и кроличьи поликлональные антитела против GFP (предоставлены Х. Рицманом) в разведении 1:3000. Мышиные моноклональные антитела против Pgk1 использовали в разведении 1:5000 (предоставлены Дж. де ла Крузом). Вторичные антитела: конъюгированные с пероксидазой хрена (HRP) козьи антитела против кроличьего иммуноглобулина G (IgG) использовали в разведении 1:3000 (Pierce). Для иммуногистохимического исследования использовали конъюгированные с HRP козьи антитела против мышиного IgG в разведении 1:3000 (Pierce). Зону иммунного ответа наблюдали методом хемилюминесценции с использованием реагента SuperSignal West Pico (Thermo Fisher Scientific).
Как описано в (31), был проведен эксперимент по естественной иммунопреципитации обогащенной фракции ЭР. Вкратце, дрожжевые клетки промывали буфером TNE [50 мМ трис-HCl (pH 7,5), 150 мМ NaCl, 5 мМ EDTA, 1 мМ фенилметилсульфонилфторида и смесь ингибиторов протеаз] при 600 нм (OD600) при оптической плотности 100 дважды. Их разрушали стеклянными шариками, а затем клеточные обломки и стеклянные шарики удаляли центрифугированием. Затем супернатант центрифугировали при 17 000 g в течение 15 минут при 4°C. Осадок ресуспендировали в TNE, и добавляли сапонин дигиталиса до конечной концентрации 1%. Суспензию инкубировали в течение 1 часа с вращением при 4°C, а затем нерастворимые компоненты удаляли центрифугированием при 13 000 g при 4°C в течение 60 минут. Для иммунопреципитации Gas1-GFP сначала предварительно инкубировали образец с пустыми агарозными шариками (ChromoTek) при 4°C в течение 1 часа, а затем инкубировали с GFP-Trap_A (ChromoTek) при 4°C в течение 3 часов. Иммунопреципитированные шарики промывали пять раз раствором TNE, содержащим 0,2% дигоксигенина, элюировали буфером для образцов SDS, разделяли методом SDS-PAGE и анализировали методом иммуноблоттинга.
Как описано в (31), определение сшивания проводилось на обогащенной фракции ЭР. Кратко, обогащенную фракцию ЭР инкубировали с 0,5 мМ дитиобис(сукцинимидилпропионатом) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Рокфорд, Иллинойс, США; 20°C, 20 мин). Реакцию сшивания останавливали добавлением глицина (конечная концентрация 50 мМ, 5 минут, 20°C).
Как описано ранее (50), был проведен масс-спектрометрический анализ церамида в штаммах дикого типа и GhLag1. Вкратце, клетки выращивали до экспоненциальной фазы (3–4 единицы OD600/мл) в среде YPD при 30°C, и собирали 25×10⁷ клеток. Их метаболизм останавливали трихлоруксусной кислотой. Использовали экстракционный растворитель [этанол, вода, эфир, пиридин и 4,2 N гидроксид аммония (15:15:5:1:0,018 об./об.)] и 1,2 нмоль внутреннего стандарта C17 церамида (860517, Avanti polar lipid). Использовали реагент монометиламина [метанол, вода, н-бутанол и раствор метиламина (4:3:1:5 об./об.)] для проведения мягкого щелочного гидролиза экстракта, а затем использовали насыщенный водой н-бутанол для обессоливания. Наконец, экстракт был ресуспендирован в растворителе положительного режима [хлороформ/метанол/вода (2:7:1) + 5 мМ ацетат аммония] и введен в масс-спектрометр. Для идентификации и количественного определения молекул сфинголипидов был проведен многореакционный мониторинг (MRM). Третичный квадрупольный масс-спектрометр TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific) оснащен роботизированным нанопотоковым ионным источником Nanomate HD (Advion Biosciences, Итака, Нью-Йорк) для анализа липидов. Энергия столкновения оптимизирована для каждой категории церамидов. Данные масс-спектрометрии были получены в положительном режиме. Для каждой биологической реплики липидный сигнал представляет собой медиану трех независимых измерений.
Как описано в (31), клетки (800×107), экспрессирующие Gas1-GFP, подвергали естественной иммунопреципитации. Очищенный Gas1-GFP разделяли методом SDS-PAGE и переносили на поливинилиденфторидную (PVDF) мембрану. Белок визуализировали путем окрашивания PVDF амидным черным. Полоса Gas1-GFP была вырезана из PVDF и промыта 5 раз метанолом и один раз водой для жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (LC-MS). Инкубируя полоску мембраны с 500 мкл 0,3 М NaOAc (pH 4,0), буфером и 500 мкл свежерастворенной смеси 1 М нитрита натрия при 37°C в течение 3 часов, липидная фракция высвобождалась из Gas1-GFP и лизировалась. Высвобождение инозинфосфата церамида между глюкозамином и инозитолом (51). После этого полоску мембраны промывали четыре раза водой для ЖХ-МС, сушили при комнатной температуре и хранили в атмосфере азота при -80°C до анализа. В качестве контроля для каждого эксперимента использовали пустой образец ПВДФ-мембраны. Липид, экстрагированный из Gas1-GFP, затем анализировали методом МС, как описано (50). Вкратце, полоски ПВДФ, содержащие GPI-липид, ресуспендировали в 75 мкл отрицательного растворителя для формования [хлороформ/метанол (1:2) + 5 мМ ацетат аммония] и подвергали электрораспылительной ионизации (ESI)-MRM/MS анализу сфинголипидных видов (TSQ Vantage). В этом случае данные МС получали в режиме отрицательных ионов.
Как упоминалось ранее, липидная часть GPI-якоря была отделена от меченного [3H]-инозитолом GPI-AP (16). Липиды были разделены методом тонкослойной хроматографии с использованием системы растворителей (55:45:10 хлороформ-метанол-0,25% KCl) и визуализированы с помощью FLA-7000 (Fujifilm).
Клетки, экспрессирующие Gas1-GFP (600×10⁷), дважды промывали буфером TNE, разрушали стеклянными шариками, а затем центрифугировали для удаления клеточного мусора и стеклянных шариков. Затем супернатант центрифугировали при 17 000 g в течение 1 часа при 4°C. Осадок промывали буфером TNE и инкубировали с 1 Ед PI-PLC (Invitrogen) в буфере TNE, содержащем 0,2% сапонина дигиталиса, в течение 1 часа при 37°C. После обработки ферментом мембрану удаляли центрифугированием при 17 000 g при 4°C в течение 1 часа. Для иммунопреципитации Gas1-GFP супернатант инкубировали с GFP-Trap_A (ChromoTek) при 4°C в течение ночи. Очищенный Gas1-GFP, разделенный методом SDS-PAGE, окрашивали кумасси бриллиантовым синим. Полоса окрашивания Gas1-GFP была отделена от серого фона, окружающего водопровод, а затем после алкилирования йодацетамидом и восстановления дитиотреитолом было проведено внутригелевое переваривание трипсином. Экстрагировали и высушивали триптические пептиды и пептиды с GPI-гликанами. Высушенный пептид растворяли в 20 мкл воды. Вводили порцию (8 мкл) в ВЭЖХ. Для разделения пептидов в условиях специфического градиента использовали колонку с октадецилсиланом (ODS) (Develosil 300ODS-HG-5; внутренний диаметр 150 мм × 1,0 мм; Nomura Chemical, префектура Айти, Япония). Подвижная фаза состояла из растворителя А (0,08% муравьиной кислоты) и растворителя В (0,15% муравьиной кислоты в 80% ацетонитриле). Для элюирования колонки растворителем А в течение 55 минут при скорости потока 50 мкл/мин в течение 5 минут использовалась система ВЭЖХ Accela (Thermo Fisher Scientific, Бостон, Массачусетс), после чего концентрация растворителя В была увеличена до 40%. (США). Элюат непрерывно подавался в источник ионов ESI, а триптические пептиды и пептиды с GPI-гликанами анализировались с помощью LTQ Orbitrap XL (гибридный линейный ионно-ловушечный масс-спектрометр с орбитальной ловушкой; Thermo Fisher Scientific). В настройке масс-спектрометра напряжение капиллярного источника было установлено на 4,5 кВ, а температура передающего капилляра поддерживалась на уровне 300°C. Напряжение капилляра и напряжение линзы трубки были установлены на 15 В и 50 В соответственно. Данные масс-спектрометрии были получены в режиме положительных ионов (разрешение 60 000; точность измерения массы 10 частей на миллион) в диапазоне масс 300/m/z отношение массы к заряду (m/z) 3000. Данные MS/MS получены через ионную ловушку в LTQ Orbitrap XL [первые 3 цифры, от которых зависят данные, диссоциация, индуцированная столкновениями (CID)].
Молекулярно-динамические симуляции проводились с использованием программного обеспечения GROMACS (52) и силового поля MARTINI 2 (53-55). Затем с помощью CHARMM GUI Membrane Builder (56, 57) был построен бислой, содержащий диолеоилфосфатидилхолин (DOPC) и Cer C18 или DOPC и Cer C26. Топология и координаты Cer C26 получены из DXCE путем удаления дополнительных шариков из сфингозинового хвоста. Используйте описанный ниже процесс для балансировки двойного слоя и запустите его, затем используйте последние координаты системы для построения системы, содержащей Emp24. Трансмембранный домен дрожжевого Emp24 (остатки 173-193) был построен в виде α-спирали с использованием инструмента визуальной молекулярной динамики (VMD) molecular structure (58). Затем, после удаления перекрывающихся липидов, белок был крупнозернисто гранулирован и введен в бислой с помощью CHARMM GUI. Конечная система содержит 1202 DOPC и 302 Cer C26 или 1197 DOPC и 295 Cer C18 и Emp24. Ионизация системы до концентрации 0,150 М. Было проведено четыре независимых повтора для двух составов бислоя.
Балансировка липидного бислоя выполняется с помощью процесса CHARMM GUI, который включает минимизацию и последующую балансировку в 405 000 шагов, при этом ограничения положения постепенно уменьшаются и устраняются, а шаг по времени увеличивается с 0,005 пс до 0,02 пс. После достижения равновесия получается 6 мкс с шагом по времени 0,02 пс. После добавления Emp24 используется тот же процесс CHARMM GUI для минимизации и балансировки системы, а затем он запускается в течение 8 с в режиме реального времени.
Во всех системах во время процесса балансировки давление контролируется баростатом Берендсена (59), а во время производственного процесса давление контролируется баростатом Парринелло-Рахмана (60). Во всех случаях среднее давление составляет 1 бар, и используется полуизотропная схема связи давления. В процессе балансировки и производства для связи температуры белковых, липидных и растворяющих частиц используется термостат (61) с калибровкой скорости. В течение всей операции целевая температура составляет 310 К. Несвязывающее взаимодействие рассчитывается путем генерации списка пар с использованием схемы Верле с допуском буфера 0,005. Кулоновский член рассчитывается с использованием реакционного поля и расстояния отсечки 1,1 нм. Для члена Ван-дер-Ваальса используется схема отсечки с расстоянием отсечки 1,1 нм, а для дрейфа потенциала используется схема отсечки Верле (62).
Используя VMD, граничная длина волны между фосфатными шариками DOPC или шариками церамида AM1 и белком составляет 0,7 нм, и рассчитывается количество липидов, взаимодействующих с белком. Согласно следующей формуле, рассчитывается коэффициент истощения-обогащения (DE), как в (63): коэффициент DE = (количество общего количества липидов в белке 0,7) в белке 0,7 (количество Cer в общем количестве липидов)
Приведенное значение получено как среднее, а погрешности представляют собой четыре независимых экземпляра SE. Статистическая значимость фактора DE рассчитывается с помощью t-критерия [(среднее значение DE - фактор - 1)/SE]. Вычислите значение P из одностороннего распределения.
Для расчета двумерной карты латеральной плотности системы, содержащей Emp24, в течение последних 250 нс трассировки использовался инструмент GROMACS. Для получения карты обогащения/обеднения церамида карта плотности Cer делится на сумму карт Cer и DOPC, а затем делится на концентрацию Cer в организме. Используется одинаковая цветовая шкала карты.
Дополнительные материалы к этой статье можно найти по адресу http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution-Non-Commercial, которая разрешает использование, распространение и воспроизведение в любом формате при условии, что конечное использование не преследует коммерческой выгоды и что оригинальная работа является корректной. Ссылка.
Примечание: Мы просим вас указать адрес электронной почты только для того, чтобы человек, которого вы рекомендуете этой странице, знал, что вы хотите, чтобы он увидел это письмо, и что это не спам. Мы не будем собирать адреса электронной почты.
Этот вопрос используется для проверки того, являетесь ли вы посетителем, и предотвращения автоматической отправки спама.
София Родригес-Гальярдо, Кадзуо Курокава, Сусана Сабидо-Бозо, Алехандро Кортес · Гомес (Алехандро Кортес-Гомес), Ацуко Икеда (Ацуко Икеда), Валерия Зони (Валерия Зони), Ауксилиадора Агилера-Ромеро, Ана Мария Перес-Линеро), Серхио Лопес (Серхио Лопес), Михо Вага (Михо Вага), Мисако Арман (Misako Arman), Мияко Риман (Miyako Riman), Проу Акира, Стефано Фанни, Акихико Накано, Мануэль Мунис
Высокоразрешающая трехмерная визуализация в реальном времени выявляет важность длины цепи церамида для сортировки белков в селективных выходных участках.
София Родригес-Гальярдо, Кадзуо Курокава, Сусана Сабидо-Бозо, Алехандро Кортес · Гомес (Алехандро Кортес-Гомес), Ацуко Икеда (Ацуко Икеда), Валерия Зони (Валерия Зони), Ауксилиадора Агилера-Ромеро, Ана Мария Перес-Линеро), Серхио Лопес (Серхио Лопес), Михо Вага (Михо Вага), Мисако Арман (Misako Arman), Мияко Риман (Miyako Riman), Проу Акира, Стефано Фанни, Акихико Накано, Мануэль Мунис
Высокоразрешающая трехмерная визуализация в реальном времени выявляет важность длины цепи церамида для сортировки белков в селективных выходных участках.
©2020 Американская ассоциация содействия развитию науки. все права защищены. AAAS является партнером HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef и COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.