В вашем браузере в данный момент отключен JavaScript. Некоторые функции этого веб-сайта не будут работать при отключенном JavaScript.
Зарегистрируйтесь, указав свои конкретные данные и интересующий вас препарат, и мы сопоставим предоставленную вами информацию со статьями в нашей обширной базе данных и немедленно вышлем вам PDF-копию по электронной почте.
Гранулы Бан-Лан-Ген ослабляют хронический рецидивирующий колит, вызванный сульфатом декстрана натрия, у мышей путем модуляции кишечной микробиоты и восстановления выработки GLP-1, полученного из короткоцепочечных жирных кислот, в кишечнике.
Цзяо Пэн,1-3,*Ли Си,4,*Чжэн Линь,3,5 Дуань Лифан,1 Гао Чжэнсянь,2,5 Диху,1 Ли Цзе,6 Ли Сяофэн,6 Шэнь Сянчунь,5 Сяо Хайтао21Пекинский университет, больница Шэньчжэня, Шэньчжэнь, Китайская Народная Республика; 2Школа фармации Центра медицинских наук Шэньчжэньского университета, Шэньчжэнь, Китайская Народная Республика; 3Научно-исследовательский центр этнической медицины и традиционной китайской медицины Гуйчжоуского медицинского университета, Министерство образования, Ключевая лаборатория фармации провинции Гуйчжоу, Гуйчжоуский медицинский университет, Гуйян, Китайская Народная Республика; 4Отделение гастроэнтерологии, больница Пекинского университета в Шэньчжэне, Шэньчжэнь, Китайская Народная Республика; 5. Фармацевтический факультет Гуйчжоуского медицинского университета, Государственная ключевая лаборатория функций и применения лекарственных растений, Гуйян; 6 Отделение лабораторной медицины, больница Шэньчжэня Пекинского университета, Шэньчжэнь, Китай [email protected] Шэнь Сянчунь, Школа фармации, Гуйчжоуский медицинский университет, Гуйчжоу, Китайская Народная Республика, 550004, Email [email protected] Цель: Терапия на основе GLP-1 является новым вариантом лечения воспалительных заболеваний кишечника. Гранулы Бан-Лан-Ген (BLG) — это известный противовирусный препарат традиционной китайской медицины, обладающий потенциальной противовоспалительной активностью при лечении различных воспалительных состояний. Однако его противовоспалительный эффект при колите и механизм действия до сих пор неясны. МЕТОДЫ: Для создания модели хронического рецидивирующего колита, индуцированного декстрансульфатом натрия (DSS), у мышей. Для оценки защитного эффекта BLG были проведены измерения индексов активности заболевания, гистологических маркеров повреждения и уровней провоспалительных цитокинов. Влияние BLG на кишечную микробиоту и кишечник характеризовалось уровнями GLP-1 в сыворотке крови и Экспрессия Gcg, GPR41 и GRP43 в толстой кишке, состав кишечной микробиоты, уровни короткоцепочечных жирных кислот (КЖК) в фекалиях и высвобождение GLP-1 из первичных эпителиальных клеток толстой кишки мышей, а также продукция GLP-1, полученного из КЖК. Результаты: Лечение BLG значительно снизило потерю массы тела, индекс диффузии в кале (DAI), укорочение толстой кишки, повреждение тканей толстой кишки и уровни провоспалительных цитокинов TNF-α, IL-1β и IL-6 в тканях толстой кишки. Кроме того, лечение BLG может значительно восстановить экспрессию Gcg, GPR41 и GRP43 в толстой кишке и уровни GLP-1 в сыворотке крови у мышей с колитом, а также увеличить количество бактерий, продуцирующих КЖК, таких как Akkermansia и Prevotellaceae_UCG-001, и уменьшить численность таких бактерий, как Eubacterium_xylanophilum_group, Ruminococcaceae_UCG-014, Intestinimonas и Oscillibacter. Кроме того, лечение гранулами Бан-Лан-Ген может значительно повысить уровень короткоцепочечных жирных кислот (КЖК) в фекалиях мышей с колитом. В то же время эксперименты in vitro также показали, что экстракт фекалий мышей, получавших лечение гранулами Бан-Лан-Ген, может значительно стимулировать секрецию GLP-1 первичными эпителиальными клетками тонкой кишки мышей. Выводы: Эти результаты свидетельствуют о том, что гранулы Бан-Лан-Ген обладают противоколитическим эффектом. Гранулы Бан-Лан-Ген потенциально могут быть разработаны в качестве терапии, по крайней мере частично, путем модуляции кишечной микробиоты и восстановления продукции GLP-1, продуцируемого КЖК в кишечнике. Перспективные препараты для лечения хронического рецидивирующего колита. Ключевые слова: колит, гранулы Бан-Лан-Ген, кишечная микробиота, короткоцепочечные жирные кислоты, GLP-1
Язвенный колит (ЯК) — это хроническое воспалительное заболевание толстой и прямой кишки, характеризующееся рецидивирующей диареей, болями в животе, потерей веса и слизисто-гнойным стулом с кровью.¹ В последнее время распространенность ЯК растет в странах с ранее низкой заболеваемостью, включая Китай, в связи с растущей популярностью западного образа жизни.² Этот рост создает серьезные проблемы для общественного здравоохранения и имеет серьезные последствия для трудоспособности пациентов и качества их жизни. Примечательно, что патогенез ЯК остается в значительной степени неясным, но общепринято, что генетические факторы, факторы окружающей среды, микробиота кишечника и иммунная система — все это способствует развитию ЯК.³ Даже сейчас нет лекарства от ЯК, и целью лечения является клинический контроль клинических симптомов, достижение и поддержание ремиссии, содействие заживлению слизистой оболочки и снижение частоты рецидивов. Классические методы лечения включают аминосалицилаты, кортикостероиды, иммуносупрессанты и биологические препараты. Однако, Эти препараты не могут достичь желаемого эффекта из-за различных побочных эффектов.4 В последнее время многочисленные исследования показали, что традиционная китайская медицина (ТКМ) обладает большим потенциалом в облегчении симптомов язвенного колита при низкой токсичности, что позволяет предположить, что разработка новых методов лечения ТКМ является многообещающей стратегией лечения язвенного колита.5-7
Гранулы Банланген (BLG) — это препарат традиционной китайской медицины, изготовленный из водного экстракта корня Банлангена.8 Помимо противовирусной эффективности, BLG проявляет потенциальную противовоспалительную активность при лечении различных воспалительных заболеваний.9,10 Кроме того, из водных экстрактов Radix isatidis были выделены и идентифицированы глюкозинолаты (R,S-гоитрин, прогоитрин, эпипрорубин и глюкозид), нуклеозиды (гипоксантин, аденозин, уридин и гуанозин) и алкалоиды индиго, такие как индиго и индирубин.11,12 Предыдущие исследования хорошо показали, что соединения аденозин, уридин и индирубин обладают мощным противоколитным действием в различных моделях колита на животных.13-17 Однако доказательных исследований для оценки эффективности BLG при колите не проводилось. В настоящем исследовании мы изучили защитный эффект Исследование BLG показало, что пероральное введение BLG значительно ослабляет вызванный DSS хронический рецидивирующий колит у мышей C57BL/6. Воспаление и его регуляторные механизмы связаны с модуляцией кишечной микробиоты и восстановлением выработки глюкагоноподобного пептида-1 (GLP-1) в кишечнике.
Гранулы BLG (без сахара, одобренные NMPA, Z11020357; Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd., Пекин, Китай; номер партии: 20110966) были приобретены в аптеках. DSS (молекулярная масса: 36 000–50 000 дальтон) был приобретен у MP Biologicals (Санта-Ана, США). Сульфасалазин (SASP) (чистота ≥ 98%), гематоксилин и эозин были приобретены у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США). Наборы для ИФА Luminex для определения TNF-α, IL-1β и IL-6 были приобретены у R&D systems (Миннеаполис, Миннесота, США). Уксусная кислота, пропионовая кислота и масляная кислота были приобретены у Aladdin Industries (Шанхай, Китай). 2-этилмасляная кислота был приобретен у компании Merck KGaA (Дармштадт, Германия).
Самцы мышей C57BL/6 в возрасте 6-8 недель (масса тела 18-22 г) были приобретены в компании Beijing Wetahe Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Пекин, Китай) и содержались в условиях 22 ± 2 °C с 12-часовым циклом свет/темнота. В течение одной недели мыши получали стандартный корм для грызунов и имели свободный доступ к питьевой воде для акклиматизации к новой среде. Затем мыши были случайным образом разделены на четыре группы: контрольная группа, группа с моделью DSS, группа, получавшая SASP (200 мг/кг, перорально), и группа, получавшая BLG (1 г/кг, перорально). Как показано на рисунке 1A, согласно нашему предыдущему исследованию, экспериментальный хронический рецидивирующий колит был индуцирован у мышей путем трех циклов 1,8% DSS в течение 5 дней, за которыми следовала дистиллированная вода в течение 7 дней.18 Мыши в группах, получавших SASP и BLG, получали SASP и BLG. соответственно, каждый день, начиная с нулевого дня. Согласно предварительным экспериментам, доза BLG была установлена ​​на уровне 1 г/кг. В то же время, согласно литературным данным, доза SASP была установлена ​​на уровне 200 мг/кг.4 Контрольная группа и группа с моделью DSS получали одинаковый объем воды на протяжении всего эксперимента.
Рисунок 1. BLG улучшает состояние мышей с хроническим рецидивирующим колитом, вызванным DSS. (A) Экспериментальная схема хронического рецидивирующего колита и лечения, (B) изменение массы тела, (C) оценка индекса активности заболевания (DAI), (D) длина толстой кишки, (E) репрезентативное изображение толстой кишки, (F) окрашивание H&E толстой кишки (увеличение ×100) и (G) гистологическая оценка. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (n = 6). ##p < 0,01 или ###p < 0,001 по сравнению с контрольной группой (Con); *p < 0,05 или **p < 0,01 или ***p < 0,001 по сравнению с группой DSS.
Ежедневно регистрировались масса тела, консистенция стула и ректальное кровотечение. Индекс активности заболевания (ИАЗ) определялся путем суммирования показателей массы тела, консистенции стула и ректального кровотечения, как описано ранее.¹⁹ В конце эксперимента все мыши были эвтаназированы, и для дальнейших экспериментов были собраны образцы крови, фекалий и толстой кишки.
Ткань толстой кишки фиксировали формалином и заливали парафином. Изготавливали срезы толщиной 5 микрон, окрашивали гематоксилином-эозином (H&E), затем проводили слепую оценку и подсчитывали баллы, как описано ранее.19
Общая РНК из ткани толстой кишки была выделена с помощью реагента Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA), после чего была проведена экстракция кДНК с использованием обратной транскриптазы (TaKaRa, Kusatsu, Shiga, Japan). Количественная ПЦР была выполнена с использованием системы ПЦР в реальном времени с SYBR Green Master (Roche, Basel, Switzerland). Транскрипты целевых генов были нормализованы по β-актину, и данные были проанализированы с использованием метода 2-ΔΔCT. Последовательности праймеров генов приведены в таблице 1.
Первичная изоляция и культивирование эпителиальных клеток толстой кишки мышей проводились, как описано ранее.²⁰ Кратко, толстую кишку мышей в возрасте 6-8 недель сначала иссекали после умерщвления путем перерезания шейного отдела позвоночника, затем продольно вскрывали, обрабатывали сбалансированным солевым раствором Хэнкса (HBSS, без кальция и магния) и разрезали на небольшие кусочки размером 0,5-1 мм. Впоследствии ткани обрабатывали 0,4 мг/мл коллагеназой XI (Sigma, Пул, Великобритания) в бесщелочной среде DMEM и центрифугировали при 300 xg в течение 5 мин при комнатной температуре. Осадок ресуспендировали в среде DMEM (дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина) при 37 °C и пропускали через нейлоновую сетку (размер пор ~250 мкм). Аликвоты эпителиальных клеток толстой кишки помещали в чашках с стеклянным дном и инкубировали с уксусной кислотой, пропионовой кислотой, масляной кислотой и экстрактами мышиных фекалий в течение 2 часов при 37°C и 5% CO2.
Ткань толстой кишки гомогенизировали с помощью фосфатно-солевого буфера (PBS), и уровни цитокинов IL-6, TNF-α и IL-1β в ткани толстой кишки определяли с использованием наборов для ИФА Luminex (R&D systems, Миннеаполис, Миннесота, США). Аналогичным образом, уровни GLP-1 в сыворотке и культуральной среде первичных эпителиальных клеток толстой кишки мышей определяли с помощью набора для ИФА (Bioswamp, Ухань, Китай) в соответствии с инструкциями производителя.
Общая ДНК из фекалий была выделена с использованием набора для выделения ДНК (Tiangen, Китай). Качество и количество ДНК измерялись при соотношении 260 нм/280 нм и 260 нм/230 нм соответственно. Затем, используя каждую выделенную ДНК в качестве матрицы, специфические праймеры 338F (ACTCCTACGGGAGGCAGCAG) и 806R (GGACTACHVGGGTWTCTAAT) использовались для амплификации V3-V4 областей гена 16S рРНК в разных регионах. Продукты ПЦР были очищены с помощью набора для выделения ДНК из геля QIAquick (QIAGEN, Германия), количественно определены методом ПЦР в реальном времени и секвенированы с использованием платформы секвенирования IlluminaMiseq PE300 (Illumina Inc., Калифорния, США). Для биоинформатического анализа обработка данных проводилась в соответствии с ранее опубликованными протоколами.21,22 Вкратце, для фильтрации необработанных данных использовался Cutadapt (V1.9.1). Анализ состава и классификации операционных таксономических единиц (OTU) проводился с использованием программы UPARSE (версия 7.0.1001) с порогом сходства 97%, а для удаления химерных последовательностей использовалась программа UCHIME. Анализ состава сообщества и классификация выполнялись с помощью классификатора RDP (http://rdp.cme.msu.edu/) на основе базы данных генов рибосомальной РНК SILVA.
Уровни короткоцепочечных жирных кислот (уксусной, пропионовой и масляной кислот) измеряли, как описано ранее Тао и др., с некоторыми модификациями.²³ Кратко, 100 мг фекалий сначала суспендировали в 0,4 мл деионизированной воды, затем добавляли 0,1 мл 50% серной кислоты и 0,5 мл 2-этилмасляной кислоты (внутренний стандарт), после чего гомогенизировали и нагревали при 4°C. Центрифугирование при 12 000 об/мин в течение 15 минут при температуре C. Надосадочную жидкость экстрагировали 0,5 мл эфира и вводили в газовый хроматограф для анализа. Для газохроматографического анализа (ГХ) образцы анализировали с помощью газового хроматографа GC-2010 Plus (Shimadzu, Inc.), оснащенного пламенно-ионизационным детектором (ПИД). Разделение осуществляли с помощью колонки ZKAT-624, 30 м × 0,53 мм × 0,3 мкм (Lanzhou Zhongke Antai Analytical Technology Co., Ltd., Китай). Данные регистрировали с помощью программного обеспечения GC solution (Shimadzu, Inc.). Коэффициент разделения составлял 10:1, газом-носителем был азот, а скорость потока — 6 мл/мин. Объем инъекции составлял 1 мкл. Температура инжектора и детектора составляла 300°C. Температуру печи поддерживали на уровне 140°C в течение 13,5 минут. Затем температуру повышали до 250°C со скоростью 120°C/мин; температуру поддерживали в течение 5 минут.
Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (СЭМ). Статистическая значимость данных оценивалась с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим множественным сравнением по Дункану. Для всех расчетов использовалось программное обеспечение GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc., Сан-Диего, Калифорния, США), и p < 0,05 считалось статистически значимым.
Хорошо известно, что язвенный колит (ЯК) — это хроническое рецидивирующее заболевание, характеризующееся сильными болями в животе, диареей и кровотечением. Поэтому для оценки противоколитной эффективности BLG была создана модель хронического рецидивирующего колита у мышей, индуцированного ДСС (рис. 1А). По сравнению с контрольной группой, у мышей в группе с моделью ДСС наблюдалось значительное снижение массы тела и более высокий индекс активности заболевания (DAI), и эти изменения были значительно обращены вспять после 24 дней лечения BLG (рис. 1B и C). Укорочение толстой кишки является важным признаком ЯК. Как показано на рисунках 1D и E, длина толстой кишки у мышей, получавших ДСС, была значительно укорочена, но была уменьшена после лечения BLG. Впоследствии был проведен гистопатологический анализ для оценки воспаления толстой кишки. Изображения, окрашенные гематоксилином и эозином, и патологические показатели показали, что введение ДСС значительно нарушало архитектуру толстой кишки и приводило к разрушению крипт, тогда как лечение BLG значительно уменьшало разрушение крипт и патологические показатели (рис. 1F и G). Примечательно, что защитный эффект Эффективность BLG в дозе 1 г/кг была сопоставима с эффективностью SASP в дозе 200 мг/кг. В совокупности эти результаты свидетельствуют об эффективности BLG в снижении тяжести хронического рецидивирующего колита, вызванного DSS, у мышей.
TNF-α, IL-1β и IL-6 являются важными маркерами воспаления толстой кишки. Как показано на рисунке 2A, DSS вызывал значительное увеличение экспрессии генов TNF-α, IL-1β и IL-6 в толстой кишке по сравнению с контрольной группой. Введение BLG может значительно обратить вспять эти изменения, вызванные DSS. Далее мы использовали ELISA для определения уровней воспалительных цитокинов TNF-α, IL-1β и IL-6 в ткани толстой кишки. Результаты также показали, что уровни TNF-α, IL-1β и IL-6 в толстой кишке были значительно повышены у мышей, получавших DSS, тогда как лечение BLG смягчало это повышение (рисунок 2B).
Рисунок 2. BLG ингибирует экспрессию генов и продукцию провоспалительных цитокинов TNF-α, IL-1β и IL-6 в толстой кишке мышей, получавших DSS. (A) Экспрессия генов TNF-α, IL-1β и IL-6 в толстой кишке; (B) уровни белков TNF-α, IL-1β и IL-6 в толстой кишке. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (n = 4–6). #p < 0,05 или ##p < 0,01 или ###p < 0,001 по сравнению с контрольной группой (Con); *p < 0,05 или **p < 0,01 по сравнению с группой DSS.
Кишечный дисбиоз играет решающую роль в патогенезе язвенного колита.24 Для исследования того, модулирует ли BLG кишечную микробиоту мышей, получавших DSS, было проведено секвенирование 16S рРНК для анализа бактериального сообщества содержимого кишечника. Диаграмма Венна показывает, что три группы имеют 385 общих ОТU. В то же время каждая группа имела уникальные ОТU (рис. 3А). Кроме того, индексы Chao1 и Шеннона, показанные на рисунках 3B и C, показали, что разнообразие сообщества кишечной микробиоты снизилось у мышей, получавших BLG, поскольку индекс Шеннона значительно уменьшился в группе, получавшей BLG. Анализ главных компонентов (PCA) и анализ главных координат (PCoA) были использованы для определения закономерностей кластеризации между тремя группами и показали, что структура сообщества мышей, получавших DSS, четко разделилась после лечения BLG (рис. 3D и E). Эти данные свидетельствуют о том, что лечение BLG значительно повлияло на структуру сообщества мышей с Колит, вызванный ДСС.
Рисунок 3. BLG изменяет разнообразие кишечной микробиоты у мышей с колитом, вызванным DSS. (A) Диаграмма Венна OTU, (B) Индекс Chao1, (C) Индекс богатства Шеннона, (D) Диаграмма результатов анализа главных компонентов (PCA) OTU, (E) Результаты анализа главных координат (PCoA) OTU. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (n = 6). **p < 0,01 по сравнению с группой DSS.
Для оценки специфических изменений в фекальной микробиоте мы проанализировали состав кишечной микробиоты на всех таксономических уровнях. Как показано на рисунке 4А, основными филами во всех группах были Firmicutes и Bacteroidetes, за которыми следовали Verrucomicrobia. Относительная численность Firmicutes и соотношение Firmicutes/Bacteroidetes были значительно увеличены в фекальных микробных сообществах мышей, получавших DSS, по сравнению с контрольными мышами, и эти изменения были значительно обращены вспять после лечения BLG. В частности, лечение BLG значительно увеличило относительную численность Verrucobacterium в фекалиях мышей с колитом, вызванным DSS. На уровне домохозяйств фекальные микробные сообщества были представлены Lachnospiriaceae, Muribaculaceae, Akkermansiaceae, Ruminococcaceae и Prevotellaceae (рис. 4B). По сравнению с группой DSS, истощение BLG увеличило численность Akkermansiaceae, но уменьшило обилие Lachnospiraceae и Ruminococcaceae. Примечательно, что на уровне рода фекальная микробиота была представлена ​​Lachnospira_NK4A136_group, Akkermansia и Prevotellaceae_UCG-001 (рис. 4C). Это открытие также продемонстрировало, что лечение BLG эффективно восстановило дисбаланс микробиоты в ответ на воздействие DSS, характеризующийся уменьшением Eubacterium_xylanophilum_group, Ruminococcaceae_UCG-014, Intestinimonas и Oscillibacter и увеличением Akkermansia и Prevotellaceae_UCG-001.
Рисунок 4. BLG изменяет численность кишечной микробиоты у мышей с колитом, вызванным DSS. (A) Численность кишечной микробиоты на уровне филума; (B) Численность кишечной микробиоты на уровне семейства; (C) Численность кишечной микробиоты на уровне рода. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (n = 6). #p < 0,05 или ###p < 0,001 по сравнению с контрольной группой (Con); *p < 0,05 или **p < 0,01 или ***p < 0,001 по сравнению с группой DSS.
Учитывая, что короткоцепочечные жирные кислоты (КЖК) являются основными метаболитами Akkermansia и Prevotellaceae_UCG-001, а ацетат, пропионат и бутират — наиболее распространенными КЖК в просвете кишечника, 25-27 мы продолжаем наше исследование. Как показано на рисунке 5, концентрации ацетата, пропионата и бутирата в фекалиях были значительно снижены в группе, получавшей DSS, в то время как лечение BLG в значительной степени подавляло это снижение.
Рисунок 5. BLG повышает уровень короткоцепочечных жирных кислот (КЖК) в фекалиях мышей с колитом, вызванным DSS. (A) Содержание уксусной кислоты в фекалиях; (B) содержание пропионовой кислоты в фекалиях; (C) содержание масляной кислоты в фекалиях. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (n = 6). #p < 0,05 или ##p < 0,01 по сравнению с контрольной группой (Con); *p < 0,05 или **p < 0,01 по сравнению с группой DSS.
Мы также рассчитали коэффициент корреляции Пирсона между дифференциальным содержанием короткоцепочечных жирных кислот (КЖК) на уровне рода и фекальной микробиотой. Как показано на рисунке 6, Akkermansia положительно коррелировала с продукцией пропионовой кислоты (Пирсон = 0,4866) и масляной кислоты (Пирсон = 0,6192). В отличие от этого, Enteromonas и Oscillobacter отрицательно коррелировали с продукцией ацетата, с коэффициентами Пирсона 0,4709 и 0,5104 соответственно. Аналогично, Ruminococcaceae_UCG-014 отрицательно коррелировала с продукцией пропионовой кислоты (Пирсон = 0,4508) и масляной кислоты (Пирсон = 0,5842) соответственно.
Рисунок 6. Корреляционный анализ Пирсона между дифференциальными короткоцепочечными жирными кислотами (КЖК) и микробами толстой кишки. (A) Энтеромонас с уксусной кислотой; (B) Бацилла Конкуссиона с уксусной кислотой; (C) Аккермансия с пропионовой кислотой; (D) Руминококк_UCG-014 с пропионовой кислотой; (E) Аккермансия с масляной кислотой; (F) Руминококк_UCG-014 с масляной кислотой.
Глюкагоноподобный пептид-1 (GLP-1) — это клеточно-специфический посттрансляционный продукт проглюкагона (Gcg), обладающий противовоспалительными свойствами.28 Как показано на рисунке 7, DSS вызвал значительное снижение экспрессии мРНК Gcg. Лечение толстой кишки и BLG могло значительно обратить вспять вызванное DSS снижение Gcg по сравнению с контрольной группой (рис. 7A). В то же время уровень GLP-1 в сыворотке был значительно снижен в группе, получавшей DSS, и лечение BLG могло в значительной степени предотвратить это снижение (рис. 7B). Поскольку короткоцепочечные жирные кислоты могут стимулировать секрецию GLP-1 посредством активации G-белкового рецептора 43 (GRP43) и G-белкового рецептора 41 (GRP41), мы также исследовали GPR41 и GRP43 в толстой кишке мышей с колитом и обнаружили, что экспрессия мРНК GRP43 и GPR41 в толстой кишке значительно снизилась после Проба с DSS и лечение BLG могли эффективно компенсировать это снижение (рисунок 7C и D).
Рисунок 7. BLG повышает уровень GLP-1 в сыворотке крови и экспрессию мРНК Gcg, GPR41 и GRP43 в толстой кишке у мышей, получавших DSS. (A) Экспрессия мРНК Gcg в ткани толстой кишки; (B) уровень GLP-1 в сыворотке крови; (C) экспрессия мРНК GPR41 в ткани толстой кишки; (D) экспрессия мРНК GPR43 в ткани толстой кишки. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (n = 5–6). #p < 0,05 или ##p < 0,01 по сравнению с контрольной группой (Con); *p < 0,05 по сравнению с группой DSS.
Поскольку лечение BLG может повышать уровни GLP-1 в сыворотке крови, экспрессию мРНК Gcg в толстой кишке и уровни короткоцепочечных жирных кислот в фекалиях у мышей, получавших DSS, мы дополнительно исследовали ацетат, пропионат и бутират, а также влияние их воздействия на высвобождение GLP-1 из первичных эпителиальных клеток толстой кишки мышей контрольной группы (F-Con), группы с колитом, вызванным DSS (F-Con -DSS), и группы с колитом, получавшей BLG (F-BLG). Как показано на рисунке 8A, первичные эпителиальные клетки толстой кишки мышей, обработанные 2 мМ уксусной кислотой, пропионовой кислотой и масляной кислотой соответственно, значительно стимулировали высвобождение GLP-1, что согласуется с предыдущими исследованиями.29,30 Аналогично, все F-Con, F-DSS и F-BLG (эквивалентно 0,25 г фекалий) значительно стимулировали высвобождение GLP-1 из первичных эпителиальных клеток толстой кишки мышей. Примечательно, что количество GLP-1, высвобождаемого Уровень экспрессии GLP-1 в первичных эпителиальных клетках толстой кишки мышей, обработанных F-DSS, был значительно ниже, чем в первичных эпителиальных клетках толстой кишки мышей, обработанных F-Con и F-BLG (рисунок 8B). Эти данные свидетельствуют о том, что обработка BLG значительно восстановила выработку GLP-1, продуцируемого короткоцепочечными жирными кислотами кишечника.
Рисунок 8. SCFA, полученные из BLG, стимулируют высвобождение GLP-1 из первичных эпителиальных клеток толстой кишки мышей. (A) Уксусная кислота, пропионовая кислота и масляная кислота стимулировали высвобождение GLP-1 из первичных эпителиальных клеток толстой кишки мышей; (B) экстракты фекалий F-Con, F-DSS и F-BLG стимулировали высвобождение GLP-1 из первичных эпителиальных клеток толстой кишки мышей. Количество высвобожденного GLP-1. Аликвоты эпителиальных клеток толстой кишки помещали в чашки Петри со стеклянным дном и обрабатывали 2 мМ уксусной кислотой, пропионовой кислотой, масляной кислотой и экстрактами фекалий F-Con, F-DSS и F-BLG (эквивалентно 0,25 г фекалий) соответственно. 2 часа при 37°C, 5% CO2, соответственно. Количество GLP-1, высвобождаемого из первичных эпителиальных клеток толстой кишки мышей, определяли методом ELISA. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (n = 3). #p < 0,05 или ##p < 0,01 по сравнению с контрольной группой или F-Con; *p < 0,05 по сравнению с F-DSS.
Сокращения: Ace, уксусная кислота; Pro, пропионовая кислота; however, масляная кислота; F-Con, экстракт фекалий контрольных мышей; F-DSS, экстракт фекалий мышей с колитом; F-BLG, экстракт фекалий мышей с воспалением толстой кишки, обработанной BLG.
Язвенный колит, включенный Всемирной организацией здравоохранения в список трудноизлечимых заболеваний, становится глобальной опасностью; Однако эффективные методы прогнозирования, профилактики и лечения этого заболевания все еще ограничены. Поэтому существует острая необходимость в изучении и разработке новых безопасных и эффективных терапевтических стратегий для лечения язвенного колита. Препараты традиционной китайской медицины являются многообещающим вариантом, поскольку многие препараты традиционной китайской медицины на протяжении веков демонстрировали эффективность в лечении язвенного колита у населения Китая, и все они представляют собой биологические органические вещества и природные материалы, в основном безвредные для человека и животных.31,32 Целью данного исследования было найти безопасный и эффективный препарат традиционной китайской медицины для лечения язвенного колита и изучить механизм его действия. BLG — это хорошо известная китайская травяная формула, используемая для лечения гриппа.8,33 Работа в нашей лаборатории и других показала, что индиго, переработанный продукт традиционной китайской медицины из того же сырья, что и BLG, демонстрирует значительную эффективность в лечении язвенного колита у людей и животных.4,34 Однако противоколитные эффекты BLG и механизм его действия остаются неясными. В настоящем исследовании наши результаты показывают, что BLG эффективно ослабляет вызванное DSS Воспаление толстой кишки, которое связано с модуляцией кишечной микробиоты и восстановлением выработки GLP-1 в кишечнике.
Хорошо известно, что язвенный колит характеризуется рецидивирующими периодами с типичными клиническими проявлениями, такими как потеря веса, диарея, ректальное кровотечение и обширное повреждение слизистой оболочки толстой кишки.35 Таким образом, хронический рецидивирующий колит вызывали путем введения трех циклов 1,8% ДСС в течение пяти дней, после чего следовал семидневный курс питьевого питания. Как показано на рисунке 1B, колебания потери веса и показателей DAI указывали на успешное индуцирование хронического рецидивирующего колита. У мышей в группе, получавшей BLG, наблюдалось улучшение состояния с 8-го дня, что значительно отличалось от 24-го дня. Аналогичные изменения наблюдались и в показателе DAI, что свидетельствует об улучшении клинического состояния при колите. Что касается повреждения толстой кишки и воспалительного статуса, то длина толстой кишки, повреждение тканей толстой кишки, а также экспрессия генов и продукция провоспалительных цитокинов TNF-α, IL-1β и IL-6 в тканях толстой кишки также значительно улучшились после лечения BLG. В совокупности эти результаты ясно демонстрируют, что BLG Эффективен в лечении хронического рецидивирующего колита у мышей.
Как BLG оказывает свое фармакологическое действие? Многочисленные предыдущие исследования показали, что кишечная микробиота играет ключевую роль в патогенезе язвенного колита, и микробиом-ориентированная и направленная на микробиом терапия стала очень привлекательной стратегией лечения язвенного колита. В настоящем исследовании мы продемонстрировали, что лечение BLG привело к значительным изменениям в составе кишечной микробиоты, предполагая, что защитный эффект BLG против колита, вызванного DSS, связан с модуляцией кишечной микробиоты. Это наблюдение согласуется с представлением о том, что перепрограммирование гомеостаза кишечной микробиоты является важным подходом к пониманию эффективности препаратов традиционной китайской медицины.36,37 Примечательно, что Akkermansia — это грамотрицательная и строго анаэробная бактерия, обитающая в слизистом слое кишечника, которая расщепляет муцины, продуцирует пропионовую кислоту, стимулирует дифференцировку бокаловидных клеток и поддерживает слизистую оболочку. функция целостности барьера.26 Многочисленные клинические и экспериментальные данные свидетельствуют о том, что Akkermansia тесно связана со здоровой слизистой оболочкой,38 и пероральное введение Akkermansia spp. может значительно улучшить воспаление слизистой оболочки.39 Наши текущие данные свидетельствуют о том, что относительная численность Akkermansia значительно увеличивается после лечения BLG. Кроме того, Prevotellaceae_UCG-001 является бактерией, продуцирующей короткоцепочечные жирные кислоты (КЖК).27 Многочисленные исследования показали, что Prevotellaceae_UCG-001 обнаруживается в фекалиях животных с колитом в низкой относительной численности.40,41 Наши данные также показывают, что лечение BLG может значительно увеличить относительную численность Prevotellaceae_UCG-001 в толстой кишке мышей, получавших DSS. В отличие от них, Oscillibacter является мезофильной, строго анаэробной бактерией.42 сообщалось, что относительная численность Oscillibacter значительно увеличивалась у мышей с язвенным колитом и значительно положительно коррелировала с уровнями IL-6 и IL-1β и патологическими показателями.43,44 Примечательно, что лечение BLG значительно снизило относительную численность Oscillibacter в фекалиях мышей, получавших DSS. мышей. Примечательно, что эти бактерии, измененные с помощью BLG, были наиболее продуцирующими короткоцепочечные жирные кислоты (КЖК). Многочисленные предыдущие исследования продемонстрировали потенциально благоприятное воздействие КЖК на воспаление толстой кишки и защиту целостности эпителия кишечника.45,46 Наши данные также показали, что концентрации ацетата, пропионата и бутирата КЖК в фекалиях мышей, обработанных DSS, значительно увеличились. В совокупности эти результаты ясно демонстрируют, что лечение BLG может эффективно усиливать индуцированное DSS продуцирующее КЖК бактериальное размножение у мышей с хроническим рецидивирующим колитом.
GLP-1 — это инкретин, вырабатываемый преимущественно в подвздошной кишке и толстом кишечнике, и он играет важную роль в замедлении опорожнения желудка и снижении уровня глюкозы в крови после приема пищи.47 Имеются данные, свидетельствующие о том, что дипептидилпептидаза (DPP)-4, агонист рецептора GLP-1, и нанопрепарат GLP-1 могут эффективно уменьшать воспаление кишечника у мышей.48-51 Как сообщалось в предыдущих исследованиях, высокие концентрации короткоцепочечных жирных кислот (КЖК) были связаны с уровнями GLP-1 в плазме крови у людей и мышей.52 Наши текущие данные показывают, что после лечения BLG уровни GLP-1 в сыворотке крови и экспрессия мРНК Gcg значительно увеличились. Аналогично, секреция GLP-1 значительно увеличилась в культурах толстой кишки после стимуляции фекальными экстрактами мышей с колитом, обработанных BLG, по сравнению со стимуляцией фекальными экстрактами мышей с колитом, обработанных DSS. Как КЖК влияют на высвобождение GLP-1? Гвен Толхерст и др. Сообщалось, что короткоцепочечные жирные кислоты (КЖК) могут стимулировать секрецию GLP-1 через GRP43 и GPR41.29 Наши данные также показывают, что лечение BLG значительно увеличивает экспрессию мРНК GRP43 и GPR41 в толстой кишке мышей, получавших DSS. Эти данные свидетельствуют о том, что лечение BLG может восстановить стимулированную КЖК продукцию GLP-1 путем активации GRP43 и GPR41.
BLG — это безрецептурный препарат длительного действия, продающийся в Китае. Максимальная переносимая доза BLG у мышей Куньмин составляет 80 г/кг, и острой токсичности не наблюдалось.53 В настоящее время рекомендуемая доза BLG (без сахара) для человека составляет 9-15 г/день (3 раза в день). Наше исследование показало, что BLG в дозе 1 г/кг облегчает хронический рецидивирующий колит, вызванный DSS, у мышей. Эта доза близка к дозе BLG, используемой в клинической практике. Наше исследование также показало, что механизм его действия опосредован, по крайней мере частично, изменениями в кишечной микробиоте, в частности, бактериями, продуцирующими короткоцепочечные жирные кислоты (SCFA), такими как Akkermansia и Prevotellaceae_UCG-001, для восстановления продукции GLP-1, вырабатываемого кишечником. Эти результаты позволяют предположить, что BLG заслуживает дальнейшего рассмотрения в качестве потенциального терапевтического средства для клинического лечения колита. Однако точный механизм, посредством которого он модулирует кишечную микробиоту, еще предстоит подтвердить на мышах с дефицитом микробиоты и фекалиях. бактериальная трансплантация.
Ace, уксусная кислота; but, масляная кислота; BLG, пандан; DSS, декстрансульфат натрия; DAI, индекс активности заболевания; DPP, дипептидилпептидаза; FID, пламенно-ионизационный детектор; F-Con, контрольные экстракты фекалий мышей; F-DSS, экстракты фекалий мышей с колитом, вызванным DSS; F-BLG, экстракты фекалий мышей с колитом, обработанных BLG; GLP-1, глюкагоноподобный пептид-1; Gcg, глюкагон; gas chromatography, газовая хроматография; GRP43, G-белковый рецептор 43; GRP41, G-белковый рецептор 41; H&E, гематоксилин-эозин; HBSS, сбалансированный солевой раствор Хэнкса; OTC, OTC; PCA, анализ главных компонентов; PCoA, анализ главных координат; Pro, пропионовая кислота; SASP, сульфасалазин; SCFA — короткоцепочечные жирные кислоты; китайская медицина — традиционная китайская медицина; UC — язвенный колит.
Все экспериментальные протоколы были одобрены Комитетом по этике животных Медицинского центра Шэньчжэньско-Гонконгского университета науки и технологий Пекинского университета (Шэньчжэнь, Китай) в соответствии с Институциональными руководящими принципами и правилами обращения с животными (номер этического разрешения A2020157).
Все авторы внесли значительный вклад в разработку концепции и дизайна, сбор данных, анализ и интерпретацию данных; участвовали в подготовке статьи или критическом пересмотре важного интеллектуального содержания; согласились представить рукопись в данный журнал; окончательно утвердили версию для публикации; несут ответственность за все аспекты работы.
Данная работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (81560676 и 81660479), проектом первого уровня Шэньчжэньского университета (86000000210), фондом Комитета по научно-техническим инновациям Шэньчжэня (JCYJ20210324093810026), а также фондом медицинских научно-технических исследований провинции Гуандун (A2020157 и A2020272), ключевой лабораторией фармацевтического факультета Гуйчжоуского медицинского университета провинции Гуйчжоу (YWZJ2020-01) и больницей Шэньчжэня Пекинского университета (JCYJ2018009).
1. Tang B, Zhu J, Zhang B, et al. Терапевтический потенциал триптолида в качестве противовоспалительного средства при экспериментальном колите, вызванном сульфатом декстрана натрия у мышей. pre-immune. 2020;11:592084. doi: 10.3389/fimmu.2020.592084
2. Kaplan GG. Глобальное бремя ВЗК: с 2015 по 2025 год. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2015;12:720–727. doi: 10.1038/nrgastro.2015.150
3. Пэн Дж., Чжэн Т.Т., Ли Сюэ и др. Алкалоиды растительного происхождения: перспективные модификаторы заболеваний при воспалительных заболеваниях кишечника. Префармакология. 2019;10:351. doi:10.3389/fphar.2019.00351
4. Сяо Хайтэн, Пэн Цзе, Вэнь Б и др. Indigo Naturalis ингибирует окислительный стресс в толстой кишке и реакции Th1/Th17 при колите, вызванном ДСС, у мышей. Oxid Med Cell Longev. 2019;2019:9480945. doi: 10.1155/2019/9480945
5. Чен М., Дин И., Тонг З. Эффективность и безопасность китайского растительного лекарственного средства Sophora flavescens (Sophora flavescens) при лечении язвенного колита: клинические данные и потенциальные механизмы. Prepharmacology. 2020;11:603476. doi:10.3389/fphar.2020.603476
6. Цао Фан, Лю Цзе, Ша Бэньсин, Пан Х.Ф. Натуральные продукты: экспериментально эффективные препараты для лечения воспалительных заболеваний кишечника. Curr Pharmaceuticals. 2019;25:4893–4913. doi: 10.2174/1381612825666191216154224
7. Чжан Ч., Цзян М., Лу А. Размышления о вспомогательном лечении язвенного колита с помощью традиционной китайской медицины. Клинический обзор аллергологии и иммунизации. 2013;44:274–283. doi: 10.1007/s12016-012-8328-9
8. Ли Чжунтэн, Ли Ли, Чен ТТ и др. Эффективность и безопасность гранул Банланген при лечении сезонного гриппа: протокол исследования для рандомизированного контролируемого исследования. Trial. 2015;16:126. doi: 10.1186/s13063-015-0645-x