Благодарим вас за посещение сайта Nature.com. Версия вашего браузера имеет ограниченную поддержку CSS. Для наилучшего взаимодействия с сайтом мы рекомендуем использовать обновленную версию браузера (или отключить режим совместимости в Internet Explorer). В настоящее время, для обеспечения дальнейшей поддержки, мы будем отображать сайт без стилей и JavaScript.
В отличие от позвоночных, насекомые, как широко считается, не имеют половых стероидных гормонов, экспрессия которых преимущественно наблюдается у самцов. У Anopheles gambiae стероид экдизон 20-гидроксиэкдизон (20E), по-видимому, эволюционировал для контроля развития яиц при синтезе самками² и для индукции периода невосприимчивости к спариванию при половой передаче самцами³. Поскольку развитие яиц и спаривание являются важными репродуктивными признаками, понимание того, как самки комаров Anopheles интегрируют эти гормональные сигналы, может способствовать разработке новых программ борьбы с малярией. Здесь мы показываем, что эти репродуктивные функции регулируются различными половыми стероидами через сложную сеть ферментов, активирующих/инактивирующих экдистероиды. Мы идентифицировали специфичный для самцов окисленный экдизон, 3-дегидро-20E (3D20E), который защищает родительские права, подавляя половую восприимчивость самок после половой передачи и активируясь путем дефосфорилирования. Примечательно, что передача 3D20E также индуцировала экспрессию репродуктивных генов. которые поддерживают развитие яиц во время заражения плазмодиями, обеспечивая здоровье инфицированных самок. Вырабатываемый самками 20E не вызывает полового ответа, но позволяет спаривающимся особям откладывать яйца после ингибирования киназ, ингибирующих 20E. Идентификация этого специфичного для самцов стероидного гормона насекомых и его роль в регулировании половой восприимчивости самок, фертильности и взаимодействия с плазмодиями предполагает потенциальную возможность снижения репродуктивного успеха комаров, переносящих малярию.
Число случаев заболевания малярией и смертей от нее снова растет4 из-за широко распространенной устойчивости к инсектицидам у комаров рода Anopheles, единственного переносчика малярийных паразитов человека. Биология спаривания этих комаров является особенно привлекательной мишенью для новых мер борьбы с малярией, поскольку самки спариваются только один раз5; стерильность этого единственного спаривания имела бы большой потенциал для сокращения популяций комаров в полевых условиях.
Женщины становятся сексуально недееспособными после получения от мужчин высоких доз стероидных гормонов. Исследования показали, что триггером, вызывающим трудности с дальнейшим спариванием, является 20-гидроксиэкдизон (20E), стероидный гормон, более известный как регулятор цикла линьки на личиночной стадии. Способность самцов синтезировать и передавать 20E развилась специфически у видов Anopheles, входящих в подрод Cellia7, распространенный в Африке и включающий наиболее опасных переносчиков малярии, в том числе Anopheles gambiae. Это особенно примечательно, поскольку у этих видов самки также вырабатывают 20E после каждого приема крови, а 20E запускает цикл оогенеза (см. ссылку 8). Однако мало что известно о том, как самки интегрируют сигналы от двух разных источников экдизона (передача от самца и индукция питания кровью), не нарушая при этом свою способность к спариванию. Фактически, если 20E, вырабатываемый самками, вызывает сексуальную непереносимость, это это приведет к бесплодию у особей, которые питались неопытными особями, что является очень распространенным поведением у этих комаров5.
Возможное объяснение заключается в том, что самцы A. gambiae передают модифицированный, специфичный для самцов экдизон, который активирует сигнальный каскад в репродуктивном тракте самки, что приводит к нестабильности спаривания. Однако, хотя у позвоночных имеется множество стероидных гормонов, таких как эстроген и андроген (обзор см. в ссылке 9), насколько нам известно, стероиды с андрогенной направленностью у насекомых не были обнаружены.
Мы поставили перед собой задачу определить репертуар стероидных гормонов в придаточной железе самцов (ПЖС) половозрелых особей A. gambiae в поисках возможных модифицирующих стероидов. Используя высокоэффективную жидкостную хроматографию в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС/МС), а не менее специфичный метод, использовавшийся ранее, мы обнаружили экдизон (E) и 20E в этой ткани, подтвердив предыдущий результат. Однако в образце преобладали окисленные фосфорилированные стероиды, соответствующие формуле 3-дегидро-20E-22-фосфат (3D20E22P)12 (рис. 1). Другие формы включают 3-дегидро-20E (3D20E) и 20E-22-фосфат (20E22P). Интенсивность сигнала ВЭЖХ-МС/МС для 3D20E22P была на два порядка выше, чем для его дефосфорилированной формы, 3D20E, и на три порядка выше, чем для его дефосфорилированной формы, 3D20E. E и 20E (Рисунок 1). Хотя в других частях тела и нижнем отделе репродуктивного тракта (НРТ; Дополнительные данные, Рис. 1a). Мы также проанализировали экдистероиды у недавно закрывшихся (<1 дня) самцов и самок и обнаружили 3D20E и 3D20E22P только в MAG; E, 20E и 20E22P присутствовали у обоих полов (Дополнительные данные, Рис. 1b). Эти данные свидетельствуют о том, что взрослые самцы A. gambiae продуцируют высокие титры модифицирующих гормонов в своих MAG, которые не синтезируются самками.
MAG и LRT самок (включая предсердия, семенные пузырьки и паравариум) были выделены из 4-дневных (4-day-old) девственных самцов и девственных и спарившихся самок (0,5, 3 и 12 ч). Экдизон в этих тканях анализировали методом ВЭЖХ-МС/МС (среднее ± стандартная ошибка среднего; непарный t-тест, двусторонний, с поправкой на ложноположительные результаты (FDR); NS, не значимо; *P < 0,05, **P < 0,01. 3D20E: 3 часа против 0,5 часа, P = 0,035; 12 часов против 3 часов, P = 0,0015; 12 часов против 0,5 часа, P = 0,030. 3D20E22P: 3 часа против 0,5 часа, P = 0,25; 12 часов против 3 часов, P = 0,0032; 12 часов против 0,5 часов, P = 0,015). Данные получены из трех биологических повторов. Площадь пика для каждого интересующего нас экдизона была рассчитана и нормализована по количеству комаров. Экдизон представлен следующим цветом: E — зеленый; 20E — оранжевый; 20E22P — фиолетовый; 3D20E — синий; 3D20E22P — розовый. На вставке увеличен масштаб по оси Y, чтобы показать более низкие уровни экдизона.
Чтобы исследовать, передаются ли 3D20E22P и 3D20E во время спаривания, мы препарировали ларингеальные жидкости самок в различные моменты времени после спаривания. Хотя экдизон не был обнаружен у девственных самок, мы наблюдали значительное количество 3D20E22P в ларингеальных жидкостях сразу после спаривания (0,5 ч после спаривания, чпм), которое со временем уменьшалось, в то время как уровень 3D20E значительно увеличивался (рис. 1). Используя химически синтезированный 3D20E в качестве стандарта, мы определили, что уровни этого стероидного гормона в ларингеальных жидкостях во время спаривания были как минимум в 100 раз выше, чем у 20E (расширенная таблица данных 1). Таким образом, 3D20E22P является основным мужским экдизоном, который передается в ларингеальные жидкости самок во время спаривания, а его дефосфорилированная форма, 3D20E, становится очень распространенной вскоре после спаривания. Это предполагает важную роль последнего экдизона в биологии самок после спаривания.
После создания нового набора данных секвенирования РНК (RNA-seq) (рис. 2a) с использованием специально разработанного биоинформатического конвейера мы провели поиск генов экдизонкиназы (EcK), экдизоноксидазы (EO) и фосфатазы, кодирующей 20E-модифицированный экдизон. EPP экспрессируется в репродуктивных тканях. Мы идентифицировали один кандидатный ген EPP и два потенциальных гена EcK (EcK1 и EcK2), но не смогли найти подходящий кандидатный ген EO. Примечательно, что отдельные гены EPP экспрессировались на высоком уровне (98,9-й процентиль) в гамбийских MAG, но не в женских LRT (рис. 2b), вопреки нашим ожиданиям, поскольку дефосфорилирование 3D20E22P происходило в этой женской ткани. Поэтому мы считаем, что EPP самцов может передаваться во время спаривания. Действительно, мы использовали мечение стабильными изотопами in vivo для маскировки женского белка после спаривания, фермента. Идентифицировано с помощью МС в предсердии самки (рис. 2c и дополнительная таблица 1). Присутствие ЭПП в MAG и у спарившихся (но не девственных) самок LRT также было подтверждено с помощью специфических антител (рис. 2d).
a) Специально разработанный биоинформатический конвейер для поиска в репродуктивных тканях каждого пола генов, кодирующих EcK, EO и EPP. Числа рядом со стрелками указывают количество кандидатов мужского и женского пола на каждом этапе. Этот анализ выявил один ген EPP (EPP) и один ген EcK (EcK1), которые экспрессируются у самцов, и один ген EcK (EcK2), который экспрессируется у обоих полов, но не дает кандидата на ген EO. b) Тепловая карта, сравнивающая экспрессию генов-кандидатов в тканях девственных (V) и спаривающихся (M) Anopheles gambiae и Anopheles albicans. Spca — оплодотворение; MAGs — придаточные железы у самцов; другие части тела, включая грудь, крылья, ноги, жировые тела и внутренние органы у обоих полов, а также яичники у самок. EcK2 высоко экспрессируется как в MAG, так и в предсердиях Гамбии, тогда как EPP обнаруживается только в MAG.c, Протеомный анализ транслокации группы эякулята самцов в предсердия самок через 3, 12 и 24 часа после сперматозоида, показывающий 67 наиболее распространенных белков. Самки выращивались на диете, содержащей 15N для мечения (и маскировки) всех белков. Немеченые самцы спаривались с мечеными самками, и LRT самок выделялись через 3, 12 и 24 часа после сперматозоида для протеомного анализа (см. дополнительную таблицу 1 для полного списка эякуляторных белков). На вставке: EPP, Eck1 и EcK2 были обнаружены в MAG девственных самцов с помощью протеомного анализа этих тканей.d, EPP был обнаружен методом вестерн-блоттинга в MAG и LRT спарившихся самцов. самок, но не у девственных самок, самцов или остальной части женского тела. Мембраны одновременно обрабатывали антителами к актину (контроль нагрузки) и антителами к EPP. Все самцы девственные. См. дополнительный рисунок 1 для исходных данных геля. Вестерн-блоттинг проводили дважды с аналогичными результатами.
Активность экдистероидфосфофосфатазы EPP была подтверждена после инкубации методом ВЭЖХ-МС/МС с 3D20E22P, выделенным из MAG (дополнительные данные, рис. 2a). Кроме того, когда мы подавили экспрессию EPP с помощью РНК-опосредованной интерференции (RNAi), мы обнаружили значительное снижение активности фосфатазы в репродуктивных тканях этих самцов (рис. 3a), а у самок, спаривавшихся с самцами с подавленной экспрессией EPP, наблюдалось значительно меньшее количество дефосфорилированного 3D20E (рис. 3b), несмотря на частичное подавление гена (дополнительные данные, рис. 2b,c). В отличие от этого, мы не обнаружили значительных изменений в соотношении 20E22P/20E у тех же комаров, что может указывать на специфичность фермента для 3D20E22P (рис. 3b).
а) Снижение активности фосфатазы в MAG, вызванное подавлением EPP с использованием двухцепочечной РНК EPP (dsEPP) или двухцепочечной РНК GFP (dsGFP) в качестве контроля. В каждой повторной пробе использовалось двадцать пулов MAG (P = 0,0046, парный t-тест, двусторонний), представленных отдельными точками. б) У самок, спаренных с самцами с подавленной активностью EPP, наблюдалась значительно более низкая доля дефосфорилированного 3D20E через 3 часа после спаривания (P = 0,0043, непарный t-тест, двусторонний), тогда как уровни 20E оставались неизменными (P = 0,063, непарный t-тест). (t-критерий, двусторонний). Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего из трех групп по 13, 16 и 19 самок в каждой. c, Самки, спарившиеся с самцами с подавленной экспрессией EPP, имели значительно более высокие показатели повторного спаривания (P = 0,0002, точный критерий Фишера, двусторонний). Самок сначала принуждали к спариванию, чтобы подтвердить их брачный статус; Через 2 дня их сопоставили с другими самцами, несущими трансгенную сперму, чтобы оценить частоту повторного спаривания с помощью количественной ПЦР-детекции трансгена. У самок, питавшихся кровью и спарившихся с самцами с подавленной экспрессией EPP, наблюдалось значительное снижение фертильности (P < 0,0001; тест Манна-Уитни, двусторонний) и незначительное снижение количества яиц (P = 0,088, тест Манна-Уитни, двусторонний), в то время как частота нереста не изменилась (P = 0,94, точный тест Фишера, двусторонний). На всех панелях n обозначает количество биологически независимых образцов комаров. NS, статистически незначимо. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001.
Далее мы оценили, важна ли дефосфорилизация экдизона для индукции устойчивости к спариванию у самок. Примечательно, что самки, спаривавшиеся с самцами с дефицитом ЭПП, повторно спаривались с гораздо большей частотой (44,9%), чем контрольные самки (10,4%) при воздействии дополнительных (трансгенных) самцов (рис. 3c). Мы также наблюдали значительное снижение фертильности (рис. 3d, слева) и небольшое снижение количества отложенных этими самками яиц (рис. 3d, посередине), в то время как процент отложенных самками яиц (еще одна реакция, вызываемая у самок спариванием) не изменился (рис. 3d, справа). Учитывая наблюдаемую специфичность ЭПП к 3D20E22P, эти результаты предполагают, что активация 3D20E ЭПП, передаваемым во время спаривания, может играть важную роль в подавлении восприимчивости самок к дальнейшему спариванию, поведению, ранее приписываемому половой передаче 20E. Поэтому это Мужской гормон также оказывает сильное влияние на женскую фертильность.
Далее мы сравнили активность 20E и 3D20E в экспериментах по инъекциям на половозрелых девственных самках, используя химически синтезированный 3D20E (рис. 4a–c) и коммерчески доступный 20E. Мы обнаружили, что 3D20E был значительно эффективнее 20E в подавлении чувствительности самок к спариванию при обеих концентрациях (рис. 4d). Примечательно, что половина физиологического уровня 3D20E в LRT (1066 пг после инъекции против 2022 пг после спаривания) вызывала долю рефрактерных самок, которая была в 20 раз выше, чем физиологический уровень 20E (361 пг после инъекции) через 24 часа после инъекции при самой высокой концентрации 18 пг после спаривания; (Расширенная таблица данных 1). Этот результат согласуется с представлением о том, что половая передача 20E не вызывает периодов невосприимчивости к спариванию, и дополнительно указывает на 3D20E как на основной фактор, обеспечивающий отношения родитель-детеныш. 3D20E также был значительно более активен, чем 20E, в тестах на яйцекладку у девственных самок (рис. 4e), что предполагает, что нормальная скорость яйцекладки, которую мы наблюдали после частичного подавления EPP, была обусловлена ​​наличием остаточной активности 3D20E, все еще продуцируемой факторами самки, индуцированными спариванием.
(a,b) 3D20E, химически синтезированный из 20E (a) с очень высокой степенью конверсии/эффективности (данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего по трем независимым реакциям синтеза) (b).c, Масс-спектр (нижняя половина) точно соответствует экдизону, обнаруженному в LRT спарившихся самок (верхняя половина).d, По сравнению с 20E (0,63 мкг, P = 0,02; 0,21 мкг, P < 0,0001; точный тест Фишера, двусторонний) и 10% этанолом (0,63 мкг, P < 0,0001; 0,21 мкг, P < 0,0001; точный тест Фишера, двусторонний), в то время как концентрация 20E была значительно выше, чем в контроле, только при более высоких дозах (0,63 мкг, P = 0,0002; 0,21 мкг, P = 0,54; точный тест Фишера, двусторонний). Инъекция 3D20E вызывала значительно более высокие показатели нереста у девственных самок, чем контрольная группа с 10% этанолом (0,21 мкг, P < 0,0001; 0,13 мкг, P = 0,0003; точный тест Фишера, двусторонний), в то время как 20E по сравнению с контрольной группой наблюдался только при более высоких дозах (0,21 мкг, P = 0,022; 0,13 мкг, P = 0,0823; точный тест Фишера, двусторонний). 3D20E вызывал значительно более высокие показатели нереста, чем 20E при более высоких дозах (0,21 мкг, P = 0,0019; 0,13 мкг, P = 0,075; точный тест Фишера, двусторонний). На всех панелях n представляет собой Количество биологически независимых образцов комаров.NS, статистически незначимо.*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001. Данные получены в результате трех повторений.
В предыдущих исследованиях мы установили, что половая передача стероидных гормонов индуцирует экспрессию MISO (Mating-Induced Stimulator of Oogenesis 11), женского репродуктивного гена, который защищает самок A. gambiae от заражения P. falciparum, самым смертоносным малярийным паразитом человека. Учитывая важность MISO для репродуктивной функции комаров рода Anopheles в эндемичных по малярии районах, мы решили определить, какой гормон — 3D20E или 20E — запускает экспрессию этого гена. Мы обнаружили, что, хотя инъекция 20E специфически или более эффективно индуцировала некоторые ядерные гормональные рецепторы (HR), такие как HR3 и HR4, и типичные нижестоящие стероидные мишени, такие как йолкогенные гены Vg14, 15, 16, MISO сильнее индуцировался 3D20E (расширенные данные, рис. 3). Таким образом, половая передача этого андрогенного стероидного гормона, по-видимому, индуцирует механизмы, которые защищают самок избегают издержек, связанных с паразитарной инфекцией. Кроме того, 3D20E по-разному влияет на обе изоформы рецептора EcR, индуцируя EcR-A и подавляя EcR-B, а также сильнее активируя другие гены, индуцирующие спаривание, включая HPX15, который влияет на фертильность самок. Это может объяснить значительное бесплодие, наблюдаемое у самок, спаренных с самцами с подавленной экспрессией EPP (расширенные данные, рис. 3). Эти данные предполагают существование нижележащих путей, преимущественно активируемых двумя гормонами экдизона, которые могут лежать в основе полоспецифической функции.
Далее мы протестировали функцию двух генов EcK, идентифицированных в нашем биоинформатическом конвейере. Подавление экспрессии EcK1 или EcK2 привело к значительной смертности у самцов (дополнительные данные, рис. 4a), что предполагает, что фосфорилирование экдизона, а следовательно, и его инактивация, важны для выживания. Поскольку EcK2 экспрессировался на более высоком уровне, чем EcK1, и был обнаружен в MAG с помощью протеомики (рис. 2b,c и дополнительная таблица 2), мы подтвердили его активность экдистероид-киназы, инкубируя его с 20E, что привело к фосфорилированию 20E22P (дополнительные данные, рис. 2).4b). При использовании 3D20E в качестве субстрата мы не смогли обнаружить фосфорилированный продукт 3D20E22P (дополнительные данные, рис. 4c), что предполагает, что 20E, а не 3D20E, может быть предпочтительной мишенью для EcK2.
Согласно нашему анализу РНК-секвенирования, EcK2 также высоко экспрессировался в LRT девственных самок, где его экспрессия отключалась после спаривания (рис. 2b). Мы подтвердили эти данные и определили, что экспрессия EcK2 не изменялась после приема крови (дополнительные данные, рис. 5a). Расширив наши первоначальные эксперименты с масс-спектрометрией, мы определили, что пик 20E22P тесно связан с пиком 20E (через 22-26 часов после приема крови; дополнительные данные, рис. 5b). Подавление экспрессии EcK2 у девственных самок привело к трехкратному увеличению относительного соотношения 20E к 20E22P через 26 часов после приема крови (дополнительные данные, рис. 2c и 5c), подтверждая, что EcK2 также фосфорилирует 20E у самок. Примечательно, что девственные самки с дефицитом EcK2 сохраняли полную половую восприимчивость (дополнительные данные, рис. 5d,e), что дополнительно подтверждает продукцию 20E самками. не вызывает периоды рефрактерности к спариванию. Однако у этих самок наблюдалось значительное увеличение скорости откладки яиц по сравнению с контрольной группой: более 30% девственных самок откладывали яйца (расширенные данные, рис. 5f). Если инъекции двухцепочечной РНК Eck2 (dsEcK2) проводились после кровососания, нерест не происходил, и пик 20E, обусловленный потреблением крови, снижался. В целом, эти результаты подтверждают модель, согласно которой 20E, продуцируемый после кровососания, может вызывать нерест, но только тогда, когда блокировка нереста (EcK2 и, возможно, другие факторы) отключается спариванием. Ни инъекции 20E, ни инъекции 3D20E не ингибировали экспрессию EcK2 у девственных самок (расширенные данные, рис. 5g), что предполагает, что другие факторы опосредуют ингибирование этой киназы. Однако уровни 20E после кровососания были недостаточны для того, чтобы вызвать дискомфорт при спаривании, но эффективно запускались высокими титрами полово-перенесенного 3D20E.
Наши результаты дают важное представление о механизмах, регулирующих репродуктивный успех A. gambiae. Появилась модель, в которой самцы эволюционировали, синтезируя высокие титры 3D20E, модифицированного экдизона, специфичного для самцов, который обеспечивает родительство, снижая чувствительность самок к дальнейшему спариванию. В то же время эти переносчики малярии также разработали эффективную систему активации 3D20E у самок в ответ на половую передачу специфичного для самцов EPP. Насколько нам известно, это первый пример системы стероидных гормонов, доминирующей у самцов и самок, выполняющей уникальную и критически важную функцию у насекомых. Функция экдизона, специфичная для самцов, постулировалась, но не была окончательно доказана. Например, в значительной степени опровергнутая гипотеза 18 заключается в том, что эти функции могут выполняться предшественником 20E E1. Хорошо известно, что у дрозофил моногамия запускается половой передачей небольших половых пептидов19,20, которые взаимодействуют с нейронами, иннервирующими репродуктивную систему самки. путь через специфические рецепторы половых пептидов21,22. Необходимы дальнейшие исследования для определения нижестоящих сигнальных каскадов, контролируемых 3D20E у самок A. gambiae, и для определения того, могут ли эти каскады сохраняться у комаров и дрозофил.
Учитывая важную роль 3D20E в фертильности и поведении самок, выявленную в нашем исследовании, пути, ведущие к синтезу и активации 3D20E, открывают новые возможности для будущих стратегий борьбы с комарами, таких как создание конкурентоспособных стерильных самцов в стратегиях стерильной технологии насекомых для выпуска в дикую природу или для имитации 3D20E в условиях девственной среды. Специфическая для самцов функция 3D20E, возможно, развилась, когда A. gambiae и другие виды Cellia приобрели способность коагулировать свою сперму в брачные пробки, поскольку это позволяет эффективно передавать большое количество гормонов и ферментов, активирующих гормоны. В свою очередь, эволюция 3D20E, реализующая моногамию, обеспечивает механизм для самок (за счет высокой экспрессии MISO) для повышения их репродуктивной способности в районах с высокой распространенностью малярии, что косвенно способствует передаче Plasmodium. Учитывая, что было показано, что женский 20E оказывает существенное влияние на выживание и рост P. falciparum у самок Anopheles комаров24, как мужские, так и женские пути метаболизма стероидных гормонов в настоящее время являются ключевыми аспектами взаимодействия комаров и паразитов.
Штаммы A. gambiae G3 выращивали в стандартных условиях для насекомых (26-28 °C, 65-80% относительной влажности, 12-часовой световой/темновой фотопериод). Личинок кормили порошкообразным кормом для рыб (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets и Tetra Pond Sticks в соотношении 7:7:2). Взрослых комаров кормили в неограниченном количестве 10% раствором декстрозы и еженедельно человеческой кровью (компоненты крови для исследования). Девственных комаров получали путем разделения полов на стадии куколки после микроскопического исследования концов. Самцы, несущие трансген DsRed, были описаны ранее.
Эксперименты по принудительному спариванию проводились в соответствии с ранее описанными протоколами. Для естественного спаривания 4-дневных девственных самок содержали в соотношении 1:3 с половозрелыми девственными самцами в течение двух ночей. В экспериментах, в которых самцам вводили dsEPP, совместное содержание в клетках совпадало с 3-4 днями после инъекции, когда активность фосфатазы была максимально подавлена ​​(расширенные данные, рис. 2b).
Ткани комаров, оставшиеся трупы (остальная часть тела) или целое тело были разделены на фрагменты и помещены в 100% метанол, после чего гомогенизированы с помощью шарикового гомогенизатора (стеклянные шарики 2 мм, 2400 об/мин, 90 сек). Количество тканей и объемы метанола были следующими: остальная часть тела, 50 мкл на 1000 мкл; MAG, 50–100 мкл на 80 мкл; самки LRT, 25–50 мкл на 80 мкл. Осадок подвергали второй экстракции метанолом в том же объеме. Клеточные остатки удаляли центрифугированием. Метанол из обеих экстракций объединяли и высушивали под потоком азота, затем ресуспендировали в следующих объемах 80% метанола в воде: остальная часть тела, 50 мкл; MAG и самки LRT, 30 мкл.
Образцы анализировались на масс-спектрометре (ID-X, Thermo Fisher), соединенном с жидкостным хроматографом (Vanquish, Thermo Fisher). 5 мкл образца вводили в колонку 3 мкм, 100 × 4,6 мм (Inspire C8, Dikma), поддерживаемую при температуре 25 °C. В качестве подвижных фаз для ЖХ использовались A (вода, 0,1% муравьиная кислота) и B (ацетонитрил, 0,1% муравьиная кислота). Градиент ЖХ был следующим: 5% B в течение 1 минуты, затем увеличение до 100% B в течение 11 минут. После 8 минут при 100% колонку уравновешивали при 5% B в течение 4 минут. Скорость потока составляла 0,3 мл/мин. Ионизация в источнике масс-спектрометра осуществлялась методом электрораспылительной ионизации с нагревом в положительном и отрицательном режимах.
Масс-спектрометр измеряет данные в диапазоне m/z от 350 до 680 с разрешением 60 000 в режиме полного MS. Данные MS/MS были получены для [M + H]+ (все мишени), [M - H2O + H]+ (все мишени) и [M - H]- (фосфорилированные мишени). Данные MS/MS использовались для подтверждения экдизоновых свойств мишеней, для которых не было доступно стандартного образца. Для идентификации нецелевых экдистероидов были проанализированы данные MS/MS для всех пиков ВЭЖХ с относительной интенсивностью >15%. Количественное определение проводилось с использованием стандартных кривых, построенных на основе чистых стандартов (20E, 3D20E), для расчета абсолютных количеств или разведений одного конкретного образца (все остальные мишени) для расчета их эквивалентности количествам, обнаруженным у одного самца. Для 3D20E количественное определение проводилось с использованием суммы следующих аддуктов: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + [Cl]-, [M + NO3]-. Данные были извлечены и количественно определены с помощью Tracefinder (версия 4.1). Данные MS/MS были проанализированы с помощью Xcalibur (версия 4.4). Спектры MS соединений E, 20E и 3D20E сравнивались с соответствующими стандартами. 3D20E22P анализировался путем дериватизации с реактивом Жирара. 20E22P анализировался по соотношению m/z.
Соединение 3D20E22P было очищено из MAG. Очистка проводилась в аналитическом масштабе с использованием высокоэффективного жидкостного хроматографа (Acquity, Waters) с квадрупольным масс-детектором (QDa, Acquity, Waters) в тех же условиях ЖХ, что и анализ HPLC-MS/MS. Сбор фракций запускался при обнаружении значения m/z, соответствующего 3D20E22P, в то же время удерживания, что и было определено ранее. Затем чистота экстрагированных соединений проверялась методом HPLC-MS/MS, как описано выше.
Общая РНК была выделена из 10-12 образцов репродуктивной ткани или других частей тела (без головки) с использованием реагента TRI (Thermo Fisher) в соответствии с инструкциями производителя. РНК обрабатывали ДНКазой TURBO (Thermo Fisher). кДНК синтезировали с использованием обратной транскриптазы вируса лейкемии мышей Молони (M-MLV RT; Thermo Fisher) в соответствии с инструкциями производителя. Праймеры для количественной ПЦР с обратной транскрипцией (RT-qPCR; расширенная таблица данных 2) были опубликованы ранее24 или разработаны с использованием Primer-BLAST26, при этом предпочтение отдавалось продуктам размером 70-150 bp, охватывающим экзон-экзонные соединения, или парам праймеров, разделяющих экзоны. Образцы кДНК из трех-четырех биологических повторов разбавляли в четыре раза водой для RT-qPCR. Количественное определение проводили в 15 мкл повторных реакциях, содержащих 1× PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), праймеры, и 5 мкл разбавленной кДНК. Реакции проводились на системе ПЦР в реальном времени QuantStudio 6 Pro (Thermo Fisher), а данные собирались и анализировались с помощью программы Design and Analysis (версия 2.4.3). Как показано в этом исследовании, относительные количества были нормализованы по рибосомальному гену RpL19 (AGAP004422), экспрессия которого существенно не изменялась при кормлении кровью 27 или спаривании 3.
Качество РНК проверяли с помощью анализатора Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent). Парные библиотеки Illumina были подготовлены и обработаны в Институте Броуда при Массачусетском технологическом институте и Гарварде. Секвенированные риды выравнивали по геному A. gambiae (штамм PEST, версия 4.12) с помощью HISAT2 (версия 2.0.5) с параметрами по умолчанию. Риды с оценкой качества картирования (MAPQ) <30 удаляли с помощью Samtools (версия 1.3.1). Количество ридов, картированных на гены, подсчитывали с помощью htseq-count (версия 0.9.1) с параметрами по умолчанию. Нормализованные значения количества ридов рассчитывали, а дифференциальную экспрессию генов анализировали с помощью пакета DESeq2 (версия 1.28.1) в R (версия 4.0.3).
Кандидаты на гены, модифицирующие экдизон, были идентифицированы путем поиска в геноме A. gambiae с использованием алгоритма PSI-BLAST (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/) с параметрами по умолчанию и следующими последовательностями белков: из Bombyx mori (номер доступа NP_001038956.1), Musca domestica (номер доступа XP_005182020.1, XP_005175332.1 и XP_011294434.1) и Microplitis demolitor (номер доступа XP_008552646.1 и XP_008552645.1); EcK из B. mori (номер доступа NP_001036900), Drosophila melanogaster (Номер доступа NP_651202), Apis mellifera (Номер доступа XP_394838) и Acyrthosiphon pisum (Номер доступа XP_001947166); и EPP из B. mori (Номер доступа XP_001947166) NP_001177919.1 и NP_001243996.1) и EO из D. melanogaster (Номер доступа NP_572986.1) (шаг 1). Далее, отфильтруйте результаты на основе высокой экспрессии мРНК (>100 фрагментов/килобаз экзонов на миллион картированных прочтений (FPKM) или >85%) в репродуктивной ткани (женские LRT или MAG) в Гамбии (шаг 2). Для повышения специфичности мы отобрали гены-кандидаты, которые также экспрессируются в репродуктивной ткани A. albimanus, вида комаров рода Anopheles, который не синтезирует и не передает экдизон во время спаривания. Гены-кандидаты были отфильтрованы на основе низкой экспрессии (<100 FPKM или <85-го процентиля) в репродуктивной ткани A. albimanus (шаг 3). В качестве окончательного фильтра (шаг 4) гены-кандидаты должны удовлетворять хотя бы одному из следующих условий: (1) значительно повышать свою экспрессию после спаривания (P < 0,05) согласно анализу дифференциально экспрессируемых генов и (2) находиться в нерепродуктивных тканях (< 85 % или <100 FPKM).
Мы модифицировали ранее описанные методы 28,29,30 для достижения изотопной маркировки всего организма. Вкратце, дикий тип Saccharomyces cerevisiae типа II (YSC2, Sigma) был протестирован в дрожжевой азотной основе (BD Difco, DF0335), содержащей (вес/объем) 2% глюкозы (G7528, Sigma), 1,7% аминокислот и сульфат аммония. в качестве единственного источника азота использовали культуральную среду) и 5% 15N сульфата аммония (NLM-713, >99%, Cambridge Isotope Laboratories). Дрожжи выделяли центрифугированием, а личинки комаров кормили вволю до окукливания. Для предотвращения смертности на четвертой стадии развития добавляли рыбную муку (0,5 мг на 300 личинок). Затем в экспериментах по спариванию с немечеными самцами использовали только самок для анализа протеома самцов, передаваемого во время спаривания.
Девственные самки в возрасте 4-6 дней, помеченные изотопом 15N, были принудительно спарены с немечеными девственными самцами того же возраста. Успешное спаривание было подтверждено обнаружением брачных пробок под эпифлуоресцентной микроскопией. Через 3, 12 и 24 часа предсердия 45-55 спаренных самок были помещены в 50 мкл буфера бикарбоната аммония (pH 7,8) и гомогенизированы пестиком. Гомогенат центрифугировали, а супернатант смешивали с 50 мкл 0,1% RapiGest (186001860, Waters) в 50 мМ бикарбонате аммония. Супернатант и осадок из каждого образца были быстро заморожены на сухом льду и отправлены экспресс-почтой в лабораторию МакКосса в Вашингтонском университете, где была завершена подготовка образцов для LC-MS/MS. Ресуспендируйте осадок в 50 мкл 0,1% раствора RapiGest в 50 мМ бикарбонате аммония и соникат в водяной бане. Концентрацию белка в осадке и супернатанте измеряли методом BCA-анализа. Образцы восстанавливали 5 мМ дитиотреитолом (DTT; Sigma), алкилировали 15 мМ йодацетамидом (Sigma) и инкубировали при 37 °C (1:0,50) в течение 1 часа (соотношение трипсинизация:трипсин:субстрат). RapiGest лизировали добавлением 200 мМ HCl, затем инкубировали при 37 °C в течение 45 минут и центрифугировали при 14 000 об/мин в течение 10 минут при 4 °C для удаления осадка. Образцы промывали методом двухрежимной твердофазной экстракции (картриджи Oasis MCX, Waters) и ресуспендировали в 0,1% муравьиной кислоте для получения конечной концентрации белка. 0,33 мкг мкл-1. Немеченые протеомы MAG были аналогичным образом проанализированы у девственных самцов. Для каждого образца было проведено два аналитических повтора. Затем 1 мкг каждого образца был проанализирован с использованием 25-сантиметровой колонки из плавленого кварца с порами 75 мкм и 4-сантиметровой ловушки с порами из плавленого кварца Kasil1 (PQ), заполненной обращенно-фазовой смолой Jupiter C12 (Phenomenex), и 180-минутной жидкостной хроматографии. Анализ образцов методом MS/MS проводился на масс-спектрометре Q-Exactive HF (Thermo Fisher) с системой nanoACQUITY UPLC (Waters). Данные, полученные для каждого запуска, были преобразованы в формат mzML с помощью Proteowizard (версия 3.0.20287) и Comet31 (версия 3.2) по базе данных FASTA, содержащей белковые последовательности Anopheles gambiae (VectorBase версия 54), Anopheles coluzzi. Поиск проводился по Mali-NIH (VectorBase версия 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, март 2021 г.), A. gambiae RNA-seq и трехкадровым трансляциям известных человеческих контаминантов. Показатели FDR, соответствующие пептидным картам, определялись с помощью Percolator32 (версия 3.05) с порогом 0,01, а пептиды объединялись в идентификацию белков с использованием Метод анализа белковой экономии в Limelight33 (версия 2.2.0). Относительное содержание белков оценивалось с использованием нормализованного коэффициента спектральной распространенности (NSAF), рассчитанного для каждого белка в каждом цикле анализа, как описано ранее. NSAF относительно каждого белка усреднялся по образцам из двух разных биологических повторов. Мечение 15N успешно маскировало женский протеом, хотя небольшое количество немеченого белка можно было обнаружить у меченых девственных самок. Мы зафиксировали обнаружение снижения содержания мужского белка (1-5 спектров) в необработанных образцах самок только в технических циклах анализа, где необработанные образцы анализировались после образцов самцов/спаривающихся самок, в результате «переноса» при ВЭЖХ. Случайные белки, обнаруженные в качестве «загрязнителей» у меченых девственных самок, перечислены в дополнительной таблице 1.
Два антигенных пептида, QTTDRVAPAPDQQQ (в пределах изотипа PA) и MESDGTTPSGDSEQ (в пределах изотипов PA и PB), были объединены, затем конъюгированы с белком-носителем KLH и введены новозеландским кроликам. После четвертой инъекции кроликов умерщвляли, и общий IgG выделяли методом аффинной хроматографии. IgG от наиболее специфичного к ЭПП кролика использовали для дальнейшего вестерн-блоттинга.
Для вестерн-блоттинга отдельно добавляли MAG (n = 10, где n представляет количество биологически независимых образцов комаров) и LRT самок (n = 30) от 4-дневных девственных самцов и девственных или принудительно спаренных самок (<10 после спаривания), буфер для экстракции белка (50 мМ Трис, pH 8,0; 1% NP-40; 0,25% дезоксихолата натрия; 150 мМ NaCl; 1 мМ ЭДТА; 1× коктейль ингибиторов протеаз (Roche)). Образцы гомогенизировали сразу после препарирования с помощью шарикового гомогенизатора (стеклянные шарики 2 мм, 2400 об/мин, 90 сек). Нерастворимые частицы удаляли центрифугированием при 20 000 g при 4 °C. Количество белков определяли методом Брэдфорда (Bio-Rad). Затем добавляли 20 мкг белка MAG, 40 100 мкг белка LRT и 20 мкг остаточного белка денатурировали и разделяли методом 10% Bis-Tris NuPAGE с использованием буфера MOPS. Белки переносили на поливинилиденфторидные мембраны с помощью системы переноса iBlot2 (Thermo Fisher). Мембраны дважды промывали в 1× PBS-T (0,1% Tween-20 в PBS), а затем блокировали в блокирующем буфере Odyssey (Li-Cor) в течение 1 часа при 22°C. Мембраны встряхивали в течение ночи при 4°C с использованием специально разработанных поликлональных первичных антител кролика против EPP (1:700 в блокирующем буфере) и моноклональных первичных антител крысы против актина MAC237 (Abeam; 1:4000). Мембраны промывали PBS-T, а затем инкубировали со вторичными антителами (ослиные антитела против кроличьих 800CW и козьи антитела против крысиных 680LT). (Li-Cor), оба в разведении 1:20 000) в блокирующем буфере, содержащем 0,01% SDS и 0,2% Tween-20, в течение 1 часа при 22 °C. Мембраны промывали PBS-T и визуализировали с помощью сканера Odyssey CLx. Изображения собирали и обрабатывали в Image Studio (версия 5.2). Специфическая полоса, соответствующая изоформе EPP-RA (82 кДа), не была обнаружена.
Кодирующие области EPP (в виде изоформы AGAP002463-RB, содержащей домен гистидинфосфатазы, поиск консервативных доменов NCBI 34) и EcK2 (AGAP002181) были клонированы в плазмиду pET-21a(+) (Novagen Millipore Sigma); Праймеры перечислены в расширенной таблице данных 2. Восемь линкеров GS4 (в тандеме) были вставлены перед С-концевым 6xHis-тегом конструкции pET-21a(+)-EcK2. Рекомбинантные белки были получены с использованием реакции синтеза белка в бесклеточной E. coli NEBExpress (New England BioLabs). Рекомбинантные белки были очищены с использованием никелевых спин-колонок NEBExpress (New England BioLabs). Контрольный белок дигидрофолат-редуктазы (DHFR) был получен с использованием ДНК-шаблона из набора для синтеза белка в бесклеточной E. coli NEBExpress. Белки хранились в 50% глицерине в PBS при -20 °C до 3 месяцев.
Фосфатазную активность ЭПП и тканевых экстрактов измеряли с использованием 4-нитрофенилфосфата (пНФФ; Sigma-Aldrich). Реакционный буфер содержал 25 мМ Трис, 50 ​​мМ уксусной кислоты, 25 мМ Бис-Трис, 150 мМ NaCl, 0,1 мМ ЭДТА и 1 мМ ДТТ. Ткань гомогенизировали в реакционном буфере, а клеточные обломки удаляли центрифугированием. Реакцию начинали добавлением фермента или тканевого экстракта в реакционный буфер, содержащий 2,5 мг/мл пНФФ. Реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре в темноте, а количество пНФФ, полученного из пНФФ, определяли путем измерения абсорбции при 405 нм в различное время.
Для определения активности EcK in vitro белок инкубировали с 0,2 мг 20E или 3D20E в 200 мкл буфера (pH 7,5), содержащего 10 мМ HEPES–NaOH, 0,1% BSA, 2 мМ ATP и 10 мМ MgCl2, в течение 2 ч при 27 °C. Реакцию останавливали добавлением 800 мкл метанола, затем охлаждали до -20 °C в течение 1 ч, после чего центрифугировали при 20 000 g в течение 10 мин при 4 °C. Затем супернатант анализировали методом ВЭЖХ-МС/МС. Для инактивации белков, используемых в контрольной группе, их инкубировали в 50% глицерине в PBS в течение 20 мин при 95 °C.
Для определения активности ЭПП in vitro белок инкубировали с 3D20E22P (эквивалентным количеству, обнаруженному в 18 парах MAG, очищенных методом ВЭЖХ-МС/МС) в 100 мкл буфера (pH 7,5), содержащего 25 мМ Трис, 50 ​​мМ уксусной кислоты, 25 мМ Бис-Триса, 150 мМ NaCl, 0,1 мМ ЭДТА и 1 мМ ДТТ, в течение 3 часов при 27 °C. Реакцию останавливали добавлением 400 мкл метанола и охлаждали до -20 °C в течение 1 часа, затем центрифугировали при 20 000 g в течение 10 минут при 4 °C. Супернатант анализировали методом ВЭЖХ-МС/МС.
Фрагменты ПЦР для EPP (362 п.н.), EcK1 (AGAP004574, 365 п.н.) и EcK2 (556 п.н.) были амплифицированы из кДНК, полученной из трупов комаров смешанного пола без головы. Фрагмент ПЦР контрольного eGFP (495 п.н.) был амплифицирован из ранее описанной pCR2.1-eGFP; Праймеры для ПЦР перечислены в дополнительной таблице данных 2. Фрагмент ПЦР был вставлен между инвертированными промоторами Т7 на плазмиде pL4440. Плазмидные конструкции были получены из компетентных клеток E. coli NEB 5-α (New England Biolabs) и проверены секвенированием ДНК перед использованием (последовательность вставки см. в дополнительных данных 1). Праймеры, соответствующие промотору Т7 (дополнительная таблица данных 2), использовались для амплификации вставки из плазмиды на основе pL4440. Размер продукта ПЦР был подтвержден электрофорезом в агарозном геле. Двуцепочечная РНК была транскрибирована из ПЦР-шаблонов с использованием набора для транскрипции Megascript T7 (Thermo Fisher) и очищена в соответствии с инструкциями производителя с ранее описанными модификациями.
Для инъекции двухцепочечной РНК (дцРНК) 1380 нг дцРНК (дцГФП, дцЭкК1, дцЭкК2, дцЭПП) вводили в грудную клетку взрослых самцов или самок (Nanoject III, Drummond) в концентрации 10 нг/нл в течение 1 дня после вылупления. Уровни подавления генов определяли как минимум в трех биологических повторах путем экстракции РНК, синтеза кДНК и ОТ-ПЦР. Для инъекции экдизона 4-дневным девственным или 6-дневным девственным самкам, питавшимся кровью, вводили 0,13, 0,21 или 0,63 мкг 20E или 3D20E (Nanoject III, Drummond) в концентрациях 1,3, 2,1 соответственно, в зависимости от экспериментальной схемы, или 6,3 нг/нл. 100 нл 10% (об/об) этанола в воде; 100 нл 3D20E22P в 10% этаноле (эквивалентно 75% от количества, обнаруженного в паре MAG). Комары были случайным образом распределены в группу инъекций.
Для экспериментов по нересту 3-дневных самок кормили человеческой кровью в неограниченном количестве. Удаляли частично накормленных или ненакормленных комаров. В зависимости от варианта эксперимента самок помещали в отдельные чашки для нереста на четыре ночи, как минимум через 48 часов после приема крови. Подсчет икры проводили под стереоскопом (Stemi 508, Zeiss); для спарившихся самок икра, из которой вылупились личинки, считалась оплодотворенной.
Для экспериментов по спариванию самкам давали как минимум 2 дня (в зависимости от варианта обработки) для развития устойчивости к спариванию, после чего в ту же клетку помещали самцов дикого типа того же возраста. Через две ночи оплодотворенные пузырьки самок извлекали, и геномную ДНК выделяли путем замораживания-оттаивания и ультразвуковой обработки в буфере, содержащем 10 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА и 25 мМ NaCl (pH 8,2). Образцы инкубировали с протеиназой К (0,86 мкг/мкл) в течение 15 минут при 55 °C, а затем в течение 10 минут при 95 °C. Препараты неочищенной геномной ДНК разбавляли в 10 раз и подвергали количественной ПЦР (qPCR) для обнаружения последовательностей Y-хромосомы; праймеры перечислены в дополнительной таблице данных 2. Отсутствие последовательности Y-хромосомы указывает на отсутствие спаривания.
Для анализа повторного спаривания самок, подвергнутых принудительному спариванию, осматривали на наличие брачных пробок для подтверждения статуса спаривания и давали им 2 дня для развития невосприимчивости к спариванию в отсутствие самцов, как описано ранее 36. Затем в клетки с самками помещали самцов, несущих трансгенные сперматозоиды DsRed. Через две ночи оплодотворяющие пузырьки извлекали из самок, и геномную ДНК готовили, как описано выше, и подвергали ПЦР-детекции трансгена DsRed; праймеры перечислены в дополнительной таблице данных 2. Отсутствие трансгена DsRed указывало на то, что повторного спаривания не происходило.
3D20E был синтезирован, как описано ранее 37. Вкратце, 10 мг 20E (Sigma-Aldrich) растворяли в 10 мл воды, после чего добавляли 30 мг платиновой черни (в порошкообразной форме, Sigma-Aldrich). В реакционную смесь непрерывно пропускали слабый поток O2, перемешивая при комнатной температуре. Через 6 часов добавляли 30 мл метанола для остановки реакции. Смесь центрифугировали для удаления частиц катализатора. Надосадочную жидкость выпаривали досуха в вакууме при комнатной температуре. Высушенный продукт реакции растворяли в 10% этаноле и метаноле для введения в HPLC-MS/MS анализ. Степень превращения (из 20E в 3D20E) составляла приблизительно 97% (рис. 4b), а масс-спектр синтезированного 3D20E соответствовал спектру, обнаруженному у спарившихся самок (рис. 4c).
В легенде приведены подробные сведения о проведенных статистических тестах. Для выполнения точного теста Фишера, теста Мантеля-Кокса и t-теста Стьюдента использовалась программа GraphPad (версия 9.0). Тесты Кохрана-Мантеля-Хензеля выполнялись с помощью пользовательского скрипта R (доступен по адресу https://github.com/duopeng/mantelhaen.test). Распределение данных проверялось на нормальность с помощью теста Шапиро-Уилка с порогом значимости 0,05. Если данные не проходили проверку на нормальность, выполнялся тест Манна-Уитни. Данные о выживаемости анализировались с помощью теста Мантеля-Кокса. Для проведения анализа дифференциальной экспрессии генов на уровне РНК-секвенирования использовался пакет DESeq2 (версия 1.28.1). Горизонтальная полоса на графике представляет медиану. В качестве порогового значения для всех тестов использовалось значение значимости P = 0,05.
Более подробную информацию о методологии исследования можно найти в аннотации к статье в журнале Nature Research Report, ссылка на которую приведена в данной статье.
Протеомные данные масс-спектрометрии были депонированы в консорциум ProteomeXchange (http://proteomecentral.proteomexchange.org) через партнерский репозиторий PRIDE (https://www.ebi.ac.uk/pride/) с идентификатором набора данных PXD032157.
Данные РНК-секвенирования депонированы в Комплексной библиотеке экспрессии генов (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) под серийной записью GSE198665.
Дополнительные наборы данных, сгенерированные и/или проанализированные в ходе данного исследования, могут быть получены от соответствующих авторов по обоснованному запросу. В данной статье представлены исходные данные.
Де Лооф, А. Экдистероиды: Забытые половые стероиды насекомых? Самцы: Черный ящик. Наука об насекомых. 13, 325–338 (2006).
Редферн, CPF 20-гидроксиэкдизон и развитие яичников у Anopheles stephens. Журнал физиологии насекомых. 28, 97–109 (1982).