Пропионовая кислота (PPA), противогрибковое средство и распространенная пищевая добавка, как было показано, вызывает аномальное нейроразвитие у мышей, сопровождающееся желудочно-кишечной дисфункцией, которая может быть вызвана дисбиозом кишечника. Была высказана гипотеза о связи между воздействием PPA с пищей и дисбиозом кишечной микробиоты, но она не была непосредственно исследована. В данном исследовании мы изучили связанные с PPA изменения в составе кишечной микробиоты, которые могут привести к дисбиозу. Кишечные микробиомы мышей, получавших необработанную диету (n=9) и диету, обогащенную PPA (n=13), были секвенированы с использованием длинноцепочечного метагеномного секвенирования для оценки различий в микробном составе и бактериальных метаболических путях. Диетическая PPA была связана с увеличением численности значимых таксонов, включая несколько видов Bacteroides, Prevotella и Ruminococcus, представители которых ранее были связаны с производством PPA. Микробиомы мышей, подвергшихся воздействию PPA, также имели больше путей, связанных с метаболизмом липидов и биосинтезом стероидных гормонов. Наши результаты показывают, что ППА может изменять микробиоту кишечника и связанные с ней метаболические пути. Эти наблюдаемые изменения подчеркивают, что консерванты, классифицируемые как безопасные для употребления, могут влиять на состав микробиоты кишечника и, в свою очередь, на здоровье человека. В зависимости от анализируемого уровня классификации выбирается P, G или S. Для минимизации влияния ложноположительных классификаций был принят минимальный порог относительной численности 1e-4 (1/10 000 прочтений). Перед статистическим анализом относительная численность, указанная Брэкеном (fraction_total_reads), была преобразована с использованием центрированного логарифмического отношения (CLR) (Aitchison, 1982). Метод CLR был выбран для преобразования данных, поскольку он масштабно-инвариантен и достаточен для неразреженных наборов данных (Gloor et al., 2017). Преобразование CLR использует натуральный логарифм. Данные подсчета, указанные Брэкеном, были нормализованы с использованием относительного логарифмического выражения (RLE) (Anders and Huber, 2010). Графики были сгенерированы с использованием комбинации matplotlib v. 3.7.1, seaborn v. 3.7.2 и последовательных логарифмов (Gloor et al., 2017). 0.12.2 и stantanotations v. 0.5.0 (Hunter, 2007; Waskom, 2021; Charlier et al., 2022). Соотношение Bacillus/Bacteroidetes рассчитывалось для каждого образца с использованием нормализованных бактериальных подсчетов. Значения, приведенные в таблицах, округлены до 4 знаков после запятой. Индекс разнообразия Симпсона рассчитывался с помощью скрипта alpha_diversity.py, входящего в пакет KrakenTools v. 1.2 (Lu et al., 2022). Отчет Bracken представлен в скрипте, а индекс Симпсона «Si» указан для параметра -an. Значимые различия в численности определялись как средние различия CLR ≥ 1 или ≤ -1. Среднее различие CLR ±1 указывает на 2,7-кратное увеличение численности типа образца. Знак (+/-) указывает, является ли таксон более многочисленным в образце PPA и контрольном образце соответственно. Значимость определялась с помощью критерия Манна-Уитни (Virtanen et al., 2020). Использовалась программа Statsmodels v. 0.14 (Benjamini and Hochberg, 1995; Seabold and Perktold, 2010), а для коррекции множественных сравнений применялась процедура Бенджамини-Хохберга. В качестве порога статистической значимости использовалось скорректированное значение p ≤ 0,05.
Микробиом человека часто называют «последним органом тела», и он играет жизненно важную роль в здоровье человека (Baquero and Nombela, 2012). В частности, кишечный микробиом известен своим системным влиянием и ролью во многих важных функциях. В кишечнике много комменсальных бактерий, занимающих множество экологических ниш, использующих питательные вещества и конкурирующих с потенциальными патогенами (Jandhyala et al., 2015). Разнообразные бактериальные компоненты кишечной микробиоты способны производить необходимые питательные вещества, такие как витамины, и способствовать пищеварению (Rowland et al., 2018). Также было показано, что бактериальные метаболиты влияют на развитие тканей и усиливают метаболические и иммунные процессы (Heijtz et al., 2011; Yu et al., 2022). Состав микробиома кишечника человека чрезвычайно разнообразен и зависит от генетических и экологических факторов, таких как диета, пол, принимаемые лекарства и состояние здоровья (Kumbhare et al., 2019).
Питание матери является важнейшим компонентом развития плода и новорожденного, а также потенциальным источником соединений, которые могут влиять на это развитие (Bazer et al., 2004; Innis, 2014). Одним из таких интересных соединений является пропионовая кислота (PPA), короткоцепочечная жирная кислота, побочный продукт бактериальной ферментации и пищевая добавка (den Besten et al., 2013). PPA обладает антибактериальными и противогрибковыми свойствами и поэтому используется в качестве пищевого консерванта, а также в промышленности для подавления роста плесени и бактерий (Wemmenhove et al., 2016). PPA оказывает различное воздействие на разные ткани. В печени PPA оказывает противовоспалительное действие, влияя на экспрессию цитокинов в макрофагах (Kawasoe et al., 2022). Этот регулирующий эффект также наблюдался в других иммунных клетках, приводя к снижению воспаления (Haase et al., 2021). Однако в головном мозге наблюдался противоположный эффект. Предыдущие исследования показали, что воздействие PPA вызывает у мышей аутистическое поведение (El-Ansary et al., 2012). Другие исследования показали, что PPA может вызывать глиоз и активировать провоспалительные пути в головном мозге (Abdelli et al., 2019). Поскольку PPA является слабой кислотой, она может проникать через эпителий кишечника в кровоток и, таким образом, преодолевать ограничительные барьеры, включая гематоэнцефалический барьер, а также плаценту (Stinson et al., 2019), что подчеркивает важность PPA как регуляторного метаболита, продуцируемого бактериями. Хотя потенциальная роль PPA как фактора риска аутизма в настоящее время изучается, его воздействие на людей с аутизмом может выходить за рамки индукции нейронной дифференциации.
Желудочно-кишечные симптомы, такие как диарея и запор, часто встречаются у пациентов с нейро developmental disorders (Cao et al., 2021). Предыдущие исследования показали, что микробиом пациентов с расстройствами аутистического спектра (РАС) отличается от микробиома здоровых людей, что указывает на наличие дисбиоза кишечной микробиоты (Finegold et al., 2010). Аналогично, характеристики микробиома пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника, ожирением, болезнью Альцгеймера и т. д. также отличаются от характеристик микробиома здоровых людей (Turnbaugh et al., 2009; Vogt et al., 2017; Henke et al., 2019). Однако до настоящего времени причинно-следственная связь между кишечным микробиомом и неврологическими заболеваниями или симптомами не установлена (Yap et al., 2021), хотя считается, что несколько видов бактерий играют роль в некоторых из этих заболеваний. Например, роды Akkermansia, Bacteroides, Clostridium, Lactobacillus, Desulfovibrio и другие более распространены в микробиоте пациентов с аутизмом (Tomova et al., 2015; Golubeva et al., 2017; Cristiano et al., 2018; Zurita et al., 2020). Примечательно, что виды некоторых из этих родов, как известно, обладают генами, связанными с продукцией PPA (Reichardt et al., 2014; Yun and Lee, 2016; Zhang et al., 2019; Baur and Dürre, 2023). Учитывая антимикробные свойства PPA, увеличение его количества может быть полезным для роста бактерий, продуцирующих PPA (Jacobson et al., 2018). Таким образом, среда, богатая ПФА, может привести к изменениям в кишечной микробиоте, включая желудочно-кишечные патогены, которые могут быть потенциальными факторами, вызывающими желудочно-кишечные симптомы.
Центральный вопрос в исследованиях микробиома заключается в том, являются ли различия в микробном составе причиной или симптомом лежащих в основе заболеваний. Первым шагом к выяснению сложной взаимосвязи между диетой, кишечным микробиомом и неврологическими заболеваниями является оценка влияния диеты на микробный состав. С этой целью мы использовали метагеномное секвенирование с длинными прочтениями для сравнения кишечных микробиомов потомства мышей, получавших диету с высоким содержанием PPA или с низким содержанием PPA. Потомство получало ту же диету, что и их матери. Мы предположили, что диета с высоким содержанием PPA приведет к изменениям в составе кишечной микробиоты и функциональных путях микробиоты, особенно тех, которые связаны с метаболизмом PPA и/или его производством.
В данном исследовании использовались трансгенные мыши FVB/N-Tg(GFAP-GFP)14Mes/J (Jackson Laboratories), экспрессирующие зеленый флуоресцентный белок (GFP) под контролем глиально-специфического промотора GFAP в соответствии с рекомендациями Комитета по этике использования животных Университета Центральной Флориды (UCF-IACUC) (номер разрешения на использование животных: PROTO202000002). После отъема от матери мыши содержались индивидуально в клетках по 1–5 мышей каждого пола в клетке. Мыши получали корм ad libitum либо очищенной контрольной диетой (модифицированная стандартная диета открытого типа, 16 ккал% жира), либо диетой с добавлением пропионата натрия (модифицированная стандартная диета открытого типа, 16 ккал% жира, содержащая 5000 ppm пропионата натрия). Количество используемого пропионата натрия было эквивалентно 5000 мг PFA/кг общей массы корма. Это самая высокая концентрация ППА, разрешенная для использования в качестве пищевого консерванта. Для подготовки к этому исследованию родительских мышей кормили обеими диетами в течение 4 недель до спаривания и продолжали кормить ими всю беременность самки. Потомство мышей [22 мыши, 9 контрольных (6 самцов, 3 самки) и 13 мышей, получавших ППА (4 самца, 9 самок)] было отлучено от матери, а затем продолжало получать ту же диету, что и самки, в течение 5 месяцев. Потомство мышей умерщвляли в возрасте 5 месяцев, собирали содержимое их кишечника и первоначально хранили в микроцентрифужных пробирках объемом 1,5 мл при -20°C, а затем переносили в морозильную камеру при -80°C до тех пор, пока не была удалена ДНК хозяина и не были выделены микробные нуклеиновые кислоты.
ДНК хозяина удаляли согласно модифицированному протоколу (Charalampous et al., 2019). Вкратце, содержимое фекалий переносили в 500 мкл InhibitEX (Qiagen, Cat#/ID: 19593) и хранили в замороженном состоянии. Обрабатывали максимум 1-2 фекальных гранулы на одну экстракцию. Затем содержимое фекалий механически гомогенизировали с помощью пластикового пестика внутри пробирки до образования суспензии. Образцы центрифугировали при 10 000 RCF в течение 5 мин или до осаждения, затем отбирали надосадочную жидкость и ресуспендировали осадок в 250 мкл 1× PBS. Добавляли 250 мкл 4,4% раствора сапонина (TCI, номер продукта S0019) в качестве детергента для разрыхления мембран эукариотических клеток. Образцы осторожно перемешивали до однородной массы и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 мин. Далее, для разрушения эукариотических клеток, к образцу добавляли 350 мкл воды, не содержащей нуклеаз, инкубировали в течение 30 с, а затем добавляли 12 мкл 5 М NaCl. После этого образцы центрифугировали при 6000 об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость отбирали и ресуспендировали осадок в 100 мкл 1X PBS. Для удаления ДНК хозяина добавляли 100 мкл буфера HL-SAN (12,8568 г NaCl, 4 мл 1М MgCl2, 36 мл воды, не содержащей нуклеаз) и 10 мкл фермента HL-SAN (ArticZymes P/N 70910-202). Образцы тщательно перемешивали пипеткой и инкубировали при 37 °C в течение 30 мин при 800 об/мин на термомиксере Eppendorf™ ThermoMixer C. После инкубации центрифугировали при 6000 об/мин в течение 3 мин и дважды промывали 800 мкл и 1000 мкл 1X PBS. Наконец, осадок ресуспендировали в 100 мкл 1X PBS.
Общая бактериальная ДНК была выделена с использованием набора для очистки геномной ДНК Monarch от New England Biolabs (New England Biolabs, Ипсвич, Массачусетс, кат. № T3010L). Стандартная процедура, прилагаемая к набору, была немного изменена. Перед началом работы инкубируйте образцы в воде, не содержащей нуклеаз, при температуре 60°C для окончательной элюции. Добавьте 10 мкл протеиназы К и 3 мкл РНКазы А к каждому образцу. Затем добавьте 100 мкл буфера для лизиса клеток и осторожно перемешайте. Затем образцы инкубировали в термомиксере Eppendorf™ ThermoMixer C при температуре 56°C и 1400 об/мин в течение не менее 1 часа и до 3 часов. Инкубированные образцы центрифугировали при 12 000 об/мин в течение 3 минут, и супернатант из каждого образца переносили в отдельную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, содержащую 400 мкл связывающего раствора. Затем пробирки перемешивали на вихревом смесителе в течение 5–10 секунд с интервалом в 1 секунду. Все жидкое содержимое каждой пробы (приблизительно 600–700 мкл) переносили в фильтрующий картридж, помещенный в проточную пробирку для сбора образцов. Пробирки центрифугировали при 1000 об/мин в течение 3 минут для обеспечения первоначального связывания ДНК, а затем центрифугировали при 12000 об/мин в течение 1 минуты для удаления остаточной жидкости. Колонку с образцом переносили в новую пробирку для сбора образцов и промывали дважды. Для первой промывки добавляли 500 мкл промывочного буфера в каждую пробирку. Переворачивали пробирку 3–5 раз, а затем центрифугировали при 12000 об/мин в течение 1 минуты. Сливали жидкость из пробирки для сбора образцов и помещали фильтрующий картридж обратно в ту же пробирку. Для второй промывки добавляли 500 мкл промывочного буфера в фильтр, не переворачивая его. Образцы центрифугировали при 12 000 об/мин в течение 1 минуты. Фильтр переносили в пробирку LoBind® объемом 1,5 мл и добавляли 100 мкл предварительно подогретой воды, не содержащей нуклеаз. Фильтры инкубировали при комнатной температуре в течение 1 минуты, а затем центрифугировали при 12 000 об/мин в течение 1 минуты. Элюированную ДНК хранили при -80°C.
Концентрацию ДНК определяли с помощью флуориметра Qubit™ 4.0. ДНК выделяли с использованием набора Qubit™ 1X dsDNA High Sensitivity Kit (кат. № Q33231) в соответствии с инструкциями производителя. Распределение длин фрагментов ДНК измеряли с помощью Agilent™ 4150 или 4200 TapeStation. ДНК выделяли с использованием реагентов Agilent™ Genomic DNA Reagents (кат. № 5067-5366) и Genomic DNA ScreenTape (кат. № 5067-5365). Подготовку библиотек проводили с использованием набора Oxford Nanopore Technologies™ (ONT) Rapid PCR Barcoding Kit (SQK-RPB004) в соответствии с инструкциями производителя. Секвенирование ДНК проводили с использованием секвенатора ONT GridION™ Mk1 с проточной ячейкой Min106D (R 9.4.1). Настройки секвенирования были следующими: высокоточная идентификация оснований, минимальное значение q равное 9, настройка штрихкода и обрезка штрихкода. Секвенирование образцов проводилось в течение 72 часов, после чего данные идентификации оснований были переданы для дальнейшей обработки и анализа.
Биоинформатическая обработка данных проводилась с использованием ранее описанных методов (Greenman et al., 2024). Полученные в результате секвенирования FASTQ-файлы были разделены на каталоги для каждого образца. Перед биоинформатическим анализом данные обрабатывались по следующей схеме: сначала FASTQ-файлы образцов объединялись в один FASTQ-файл. Затем риды короче 1000 bp фильтровались с помощью Filtlong v. 0.2.1, при этом изменялся только параметр –min_length 1000 (Wick, 2024). Перед дальнейшей фильтрацией качество ридов контролировалось с помощью NanoPlot v. 1.41.3 со следующими параметрами: –fastq –plots dot –N50 -o
Для таксономической классификации риды и собранные контиги были классифицированы с использованием Kraken2 версии 2.1.2 (Wood et al., 2019). Сгенерируйте отчеты и выходные файлы для ридов и сборок соответственно. Используйте опцию –use-names для анализа ридов и сборок. Опции –gzip-compressed и –paired указаны для сегментов ридов. Относительная численность таксонов в метагеномах была оценена с использованием Bracken версии 2.8 (Lu et al., 2017). Сначала мы создали базу данных k-меров, содержащую 1000 оснований, используя bracken-build со следующими параметрами: -d
Аннотация генов и оценка относительной численности проводились с использованием модифицированной версии протокола, описанного Марангой и др. (Maranga et al., 2023). Сначала из всех сборок были удалены контиги короче 500 bp с помощью SeqKit v. 2.5.1 (Shen et al., 2016). Затем выбранные сборки были объединены в пан-метагеном. Открытые рамки считывания (ОРС) были идентифицированы с помощью Prodigal v. 1.0.1 (параллельная версия Prodigal v. 2.6.3) со следующими параметрами: -d
Гены были сначала сгруппированы в соответствии с идентификаторами ортологов (KO) Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG), присвоенными eggNOG, для сравнения количества генов в метаболических путях. Гены без нокаутов или гены с множественными нокаутами были удалены перед анализом. Затем было рассчитано среднее количество каждого KO в образце, и был проведен статистический анализ. Гены метаболизма PPA определялись как любые гены, которым была присвоена строка ko00640 в столбце KEGG_Pathway, указывающая на роль в метаболизме пропионата согласно KEGG. Гены, идентифицированные как связанные с производством PPA, перечислены в дополнительной таблице 1 (Reichardt et al., 2014; Yang et al., 2017). Были проведены перестановочные тесты для выявления генов метаболизма и производства PPA, которые были значительно более многочисленны в каждом типе образца. Для каждого анализируемого гена было выполнено тысяча перестановок. В качестве порогового значения для определения статистической значимости использовалось значение p < 0,05. Функциональные аннотации присваивались отдельным генам внутри кластера на основе аннотаций репрезентативных генов внутри кластера. Таксоны, связанные с метаболизмом PPA и/или производством PPA, можно было идентифицировать путем сопоставления идентификаторов контигов в выходных файлах Kraken2 с теми же идентификаторами контигов, которые сохранялись во время функциональной аннотации с использованием eggNOG. Проверка значимости проводилась с использованием U-теста Манна-Уитни, описанного ранее. Коррекция на множественное тестирование проводилась с использованием процедуры Бенджамини-Хохберга. В качестве порогового значения для определения статистической значимости использовалось значение p ≤ 0,05.
Разнообразие кишечного микробиома мышей оценивали с помощью индекса разнообразия Симпсона. Значимых различий между контрольными образцами и образцами, обработанными PPA, по родовому и видовому разнообразию не наблюдалось (p-значение для рода: 0,18, p-значение для вида: 0,16) (Рисунок 1). Затем микробный состав сравнивали с помощью анализа главных компонентов (PCA). На рисунке 2 показано кластерирование образцов по их филумам, указывающее на различия в видовом составе микробиомов между образцами, обработанными PPA, и контрольными образцами. Это кластерирование было менее выраженным на уровне рода, что предполагает, что PPA влияет на определенные бактерии (Дополнительный рисунок 1).
Рисунок 1. Альфа-разнообразие родов и видовой состав микробиома кишечника мышей. Диаграммы размаха, показывающие индексы разнообразия Симпсона для родов (A) и видов (B) в образцах PPA и контрольных образцах. Значимость определялась с помощью критерия Манна-Уитни, а коррекция множественных сравнений проводилась с использованием процедуры Бенджамини-Хохберга. ns, p-значение не является статистически значимым (p>0,05).
Рисунок 2. Результаты анализа главных компонентов состава микробиома кишечника мышей на видовом уровне. На графике анализа главных компонентов показано распределение образцов по их первым двум главным компонентам. Цвета указывают на тип образца: мыши, подвергшиеся воздействию PPA, обозначены фиолетовым цветом, а контрольные мыши — желтым. Главные компоненты 1 и 2 отложены по осям x и y соответственно и выражены в виде отношения объясненной дисперсии.
Используя данные подсчета, преобразованные с помощью RLE, было обнаружено значительное снижение медианного соотношения Bacteroidetes/Bacilli у контрольных мышей и мышей с PPA (контроль: 9,66, PPA: 3,02; p-значение = 0,0011). Это различие было обусловлено более высокой численностью Bacteroidetes у мышей с PPA по сравнению с контрольной группой, хотя разница не была статистически значимой (среднее значение CLR в контрольной группе: 5,51, среднее значение CLR в группе PPA: 6,62; p-значение = 0,054), в то время как численность Bacteroidetes была схожей (среднее значение CLR в контрольной группе: 7,76, среднее значение CLR в группе PPA: 7,60; p-значение = 0,18).
Анализ численности таксономических представителей кишечного микробиома показал, что 1 филум и 77 видов значительно различались между образцами PPA и контрольными образцами (дополнительная таблица 2). Численность 59 видов в образцах PPA была значительно выше, чем в контрольных образцах, в то время как численность только 16 видов в контрольных образцах была выше, чем в образцах PPA (рисунок 3).
Рисунок 3. Различия в численности таксонов в кишечном микробиоме мышей, получавших ППА, и контрольных мышей. Вулканические диаграммы показывают различия в численности родов (А) или видов (В) между образцами, получавшими ППА, и контрольными образцами. Серые точки указывают на отсутствие значимых различий в численности таксонов. Цветные точки указывают на значимые различия в численности (p-значение ≤ 0,05). 20 таксонов с наибольшими различиями в численности между типами образцов показаны красным и светло-голубым цветом (контрольные образцы и образцы, получавшие ППА) соответственно. Желтые и фиолетовые точки были как минимум в 2,7 раза более многочисленны в контрольных образцах или образцах, получавших ППА, чем в контрольных образцах. Черные точки представляют таксоны со значительно различающейся численностью, со средними различиями CLR от -1 до 1. Значения p были рассчитаны с использованием критерия Манна-Уитни и скорректированы на множественное тестирование с использованием процедуры Бенджамини-Хохберга. Жирным шрифтом выделены средние различия CLR, указывающие на значимые различия в численности.
После анализа состава кишечной микробиоты мы провели функциональную аннотацию микробиома. После фильтрации низкокачественных генов было идентифицировано в общей сложности 378 355 уникальных генов во всех образцах. Преобразованная численность этих генов была использована для анализа главных компонентов (PCA), и результаты показали высокую степень кластеризации типов образцов на основе их функциональных профилей (Рисунок 4).
Рисунок 4. Результаты анализа главных компонентов (PCA) с использованием функционального профиля микробиома кишечника мышей. На графике PCA показано распределение образцов по их первым двум главным компонентам. Цвета указывают на тип образца: мыши, подвергшиеся воздействию PPA, обозначены фиолетовым цветом, а контрольные мыши — желтым. Главные компоненты 1 и 2 отложены по осям x и y соответственно и выражены в виде отношения объясненной дисперсии.
Далее мы исследовали распространенность нокаутов KEGG в различных типах образцов. Всего было выявлено 3648 уникальных нокаутов, из которых 196 были значительно более распространены в контрольных образцах, а 106 — в образцах PPA (рисунок 5). В контрольных образцах было обнаружено в общей сложности 145 генов, а в образцах PPA — 61 ген, с существенно различающейся распространенностью. Пути, связанные с метаболизмом липидов и аминосахаров, были значительно более обогащены в образцах PPA (дополнительная таблица 3). Пути, связанные с метаболизмом азота и системами переноса серы, были значительно более обогащены в контрольных образцах (дополнительная таблица 3). Распространенность генов, связанных с метаболизмом аминосахаров/нуклеотидов (ko:K21279) и метаболизмом инозитолфосфата (ko:K07291), была значительно выше в образцах PPA (рисунок 5). В контрольных образцах было значительно больше генов, связанных с метаболизмом бензоата (ko:K22270), метаболизмом азота (ko:K00368) и гликолизом/глюконеогенезом (ko:K00131) (Рисунок 5).
Рис. 5. Различия в численности КО в кишечном микробиоме мышей PPA и контрольной группы. Вулканический график отображает различия в численности функциональных групп (КО). Серые точки обозначают КО, численность которых существенно не различалась между типами образцов (p-значение > 0,05). Цветные точки обозначают существенные различия в численности (p-значение ≤ 0,05). 20 КО с наибольшими различиями в численности между типами образцов показаны красным и светло-голубым цветом, что соответствует контрольным образцам и образцам PPA соответственно. Желтые и фиолетовые точки обозначают КО, численность которых была как минимум в 2,7 раза выше в контрольных образцах и образцах PPA соответственно. Черные точки обозначают КО со значительно различающейся численностью, при этом средние различия CLR находятся в диапазоне от -1 до 1. Значения p были рассчитаны с использованием критерия Манна-Уитни и скорректированы для множественных сравнений с использованием процедуры Бенджамини-Хохберга. NaN означает, что КО не принадлежит к пути в KEGG. Выделенные жирным шрифтом средние значения разницы CLR указывают на существенные различия в количестве. Подробную информацию о путях, к которым относятся перечисленные KO, см. в дополнительной таблице 3.
Среди аннотированных генов 1601 ген имел значительно различающуюся численность между типами образцов (p ≤ 0,05), при этом каждый ген был как минимум в 2,7 раза более распространен. Из этих генов 4 гена были более распространены в контрольных образцах, а 1597 генов — в образцах PPA. Поскольку PPA обладает антимикробными свойствами, мы исследовали численность генов метаболизма и продукции PPA между типами образцов. Среди 1332 генов, связанных с метаболизмом PPA, 27 генов были значительно более распространены в контрольных образцах, а 12 генов — в образцах PPA. Среди 223 генов, связанных с продукцией PPA, 1 ген был значительно более распространен в образцах PPA. На рисунке 6A дополнительно демонстрируется более высокая численность генов, участвующих в метаболизме PPA, со значительно более высокой численностью в контрольных образцах и большими размерами эффекта, в то время как на рисунке 6B выделены отдельные гены со значительно более высокой численностью, наблюдаемой в образцах PPA.
Рис. 6. Различия в количестве генов, связанных с ППА, в микробиоме кишечника мышей. Вулканические диаграммы отображают различия в количестве генов, связанных с метаболизмом ППА (А) и продукцией ППА (В). Серые точки обозначают гены, количество которых существенно не различалось между типами образцов (p-значение > 0,05). Цветные точки обозначают существенные различия в количестве (p-значение ≤ 0,05). 20 генов с наибольшими различиями в количестве показаны красным и светло-голубым цветом (контрольные образцы и образцы с ППА) соответственно. Количество желтых и фиолетовых точек было как минимум в 2,7 раза больше в контрольных образцах и образцах с ППА, чем в контрольных образцах. Черные точки представляют гены со значительно различающимся количеством, со средними различиями CLR от -1 до 1. Значения p были рассчитаны с использованием критерия Манна-Уитни и скорректированы на множественные сравнения с использованием процедуры Бенджамини-Хохберга. Гены соответствуют репрезентативным генам в не избыточном каталоге генов. Названия генов состоят из символа KEGG, обозначающего нокаутированный ген. Жирным шрифтом выделены средние различия CLR, указывающие на статистически значимые различия в количестве генов. Тире (-) означает, что в базе данных KEGG отсутствует символ для данного гена.
Таксоны, содержащие гены, связанные с метаболизмом и/или производством ППА, были идентифицированы путем сопоставления таксономической идентичности контигов с идентификатором контига гена. На уровне рода было обнаружено 130 родов, имеющих гены, связанные с метаболизмом ППА, и 61 род, имеющий гены, связанные с производством ППА (дополнительная таблица 4). Однако ни один из родов не показал существенных различий в численности (p > 0,05).
На видовом уровне было обнаружено 144 вида бактерий, имеющих гены, связанные с метаболизмом ППА, и 68 видов бактерий, имеющих гены, связанные с производством ППА (дополнительная таблица 5). Среди бактерий, метаболизирующих ППА, у восьми видов наблюдалось значительное увеличение численности между типами образцов, и у всех были отмечены значительные изменения эффекта (дополнительная таблица 6). Все идентифицированные бактерии, метаболизирующие ППА и имеющие значительные различия в численности, были более многочисленны в образцах ППА. Классификация на видовом уровне выявила представителей родов, которые не имели значительных различий между типами образцов, включая несколько видов Bacteroides и Ruminococcus, а также Duncania dubois, Myxobacterium enterica, Monococcus pectinolyticus и Alcaligenes polymorpha. Среди бактерий, продуцирующих ППА, у четырех видов наблюдались значительные различия в численности между типами образцов. К видам со значительными различиями в численности относятся Bacteroides novorossi, Duncania dubois, Myxobacterium enteritidis и Ruminococcus bovis.
В данном исследовании мы изучили влияние воздействия ППА на кишечную микробиоту мышей. ППА может вызывать различные реакции у бактерий, поскольку он вырабатывается определенными видами, используется в качестве источника пищи другими видами или обладает антимикробным действием. Поэтому его добавление в кишечную среду посредством диетической добавки может иметь различные эффекты в зависимости от толерантности, восприимчивости и способности использовать его в качестве источника питательных веществ. Чувствительные виды бактерий могут быть элиминированы и заменены видами, более устойчивыми к ППА или способными использовать его в качестве источника пищи, что приводит к изменениям в составе кишечной микробиоты. Наши результаты выявили значительные различия в микробном составе, но не показали влияния на общее микробное разнообразие. Наибольшие эффекты наблюдались на видовом уровне: более 70 таксонов значительно различались по численности между образцами, подвергнутыми воздействию ППА, и контрольными образцами (дополнительная таблица 2). Дальнейшая оценка состава образцов, подвергнутых воздействию PPA, выявила большую гетерогенность микробных видов по сравнению с образцами, не подвергавшимися воздействию, что позволяет предположить, что PPA может усиливать характеристики роста бактерий и ограничивать популяции бактерий, способных выживать в среде, богатой PPA. Таким образом, PPA может избирательно вызывать изменения, а не приводить к широкомасштабному нарушению разнообразия кишечной микробиоты.
Ранее было показано, что пищевые консерванты, такие как PPA, изменяют численность компонентов кишечного микробиома, не влияя на общее разнообразие (Nagpal et al., 2021). В данном исследовании мы наблюдали наиболее заметные различия между видами Bacteroidetes в пределах филума Bacteroidetes (ранее известного как Bacteroidetes), численность которых была значительно выше у мышей, подвергшихся воздействию PPA. Увеличение численности видов Bacteroides связано с усилением деградации слизи, что может повысить риск инфекции и способствовать воспалению (Cornick et al., 2015; Desai et al., 2016; Penzol et al., 2019). Одно исследование показало, что у новорожденных самцов мышей, получавших Bacteroides fragilis, наблюдалось социальное поведение, напоминающее расстройство аутистического спектра (РАС) (Carmel et al., 2023), а другие исследования продемонстрировали, что виды Bacteroides могут изменять иммунную активность и приводить к аутоиммунной воспалительной кардиомиопатии (Gil-Cruz et al., 2019). Также значительно увеличилось количество видов, принадлежащих к родам Ruminococcus, Prevotella и Parabacteroides, у мышей, подвергшихся воздействию PPA (Coretti et al., 2018). Некоторые виды Ruminococcus связаны с такими заболеваниями, как болезнь Крона, посредством выработки провоспалительных цитокинов (Henke et al., 2019), в то время как виды Prevotella, такие как Prevotella humani, связаны с метаболическими заболеваниями, такими как гипертония и чувствительность к инсулину (Pedersen et al., 2016; Li et al., 2017). Наконец, мы обнаружили, что соотношение Bacteroidetes (ранее известных как Firmicutes) к Bacteroidetes было значительно ниже у мышей, подвергшихся воздействию PPA, чем у контрольных мышей, из-за более высокой общей численности видов Bacteroidetes. Ранее было показано, что это соотношение является важным индикатором кишечного гомеостаза, а нарушения этого соотношения были связаны с различными заболеваниями (Turpin et al., 2016; Takezawa et al., 2021; An et al., 2023), включая воспалительные заболевания кишечника (Stojanov et al., 2020). В совокупности виды филума Bacteroidetes, по-видимому, наиболее сильно страдают от повышенного содержания PPA в пище. Это может быть связано с более высокой толерантностью к PPA или способностью использовать PPA в качестве источника энергии, что было подтверждено, по крайней мере, для одного вида, Hoylesella enocea (Hitch et al., 2022). В качестве альтернативного объяснения можно предположить, что воздействие ППА на мать может способствовать развитию плода, делая кишечник потомства мышей более восприимчивым к колонизации бактериями рода Bacteroidetes; однако дизайн нашего исследования не позволял провести такую оценку.
Оценка метагеномного содержания выявила значительные различия в количестве генов, связанных с метаболизмом и продукцией PPA: у мышей, подвергшихся воздействию PPA, наблюдалось большее количество генов, ответственных за продукцию PPA, тогда как у мышей, не подвергавшихся воздействию PPA, наблюдалось большее количество генов, ответственных за метаболизм PAA (Рисунок 6). Эти результаты предполагают, что влияние PPA на микробный состав может быть обусловлено не только его применением, иначе количество генов, связанных с метаболизмом PPA, должно было бы быть выше в кишечном микробиоме мышей, подвергшихся воздействию PPA. Одно из объяснений заключается в том, что PPA опосредует увеличение численности бактерий в основном за счет своего антимикробного действия, а не за счет использования бактериями в качестве питательного вещества. Предыдущие исследования показали, что PPA ингибирует рост Salmonella Typhimurium дозозависимым образом (Jacobson et al., 2018). Воздействие более высоких концентраций PPA может способствовать отбору бактерий, устойчивых к его антимикробным свойствам и не обязательно способных метаболизировать или продуцировать его. Например, несколько видов Parabacteroides показали значительно более высокую численность в образцах PPA, но гены, связанные с метаболизмом или производством PPA, обнаружены не были (дополнительные таблицы 2, 4 и 5). Кроме того, производство PPA в качестве побочного продукта ферментации широко распространено среди различных бактерий (Gonzalez-Garcia et al., 2017). Более высокое бактериальное разнообразие может быть причиной более высокой численности генов, связанных с метаболизмом PPA, в контрольных образцах (Averina et al., 2020). Более того, только 27 (2,14%) из 1332 генов были предсказаны как гены, связанные исключительно с метаболизмом PPA. Многие гены, связанные с метаболизмом PPA, также участвуют в других метаболических путях. Это дополнительно демонстрирует, что численность генов, участвующих в метаболизме PPA, была выше в контрольных образцах; эти гены могут функционировать в путях, которые не приводят к использованию PPA или его образованию в качестве побочного продукта. В этом случае только один ген, связанный с образованием PPA, показал значительные различия в численности между типами образцов. В отличие от генов, связанных с метаболизмом ППА, были выбраны маркерные гены для производства ППА, поскольку они непосредственно участвуют в бактериальном пути производства ППА. У мышей, подвергшихся воздействию ППА, было обнаружено значительное увеличение численности и способности к производству ППА у всех видов. Это подтверждает предположение о том, что ППА будут отбирать продуцентов ППА и, следовательно, предсказывать увеличение способности к производству ППА. Однако численность генов не обязательно коррелирует с их экспрессией; таким образом, хотя численность генов, связанных с метаболизмом ППА, выше в контрольных образцах, скорость экспрессии может быть иной (Shi et al., 2014). Для подтверждения связи между распространенностью генов, продуцирующих ППА, и производством ППА необходимы исследования экспрессии генов, участвующих в производстве ППА.
Функциональная аннотация метагеномов PPA и контрольной группы выявила некоторые различия. Анализ главных компонент (PCA) содержания генов показал наличие дискретных кластеров между образцами PPA и контрольной группой (рисунок 5). Кластеризация внутри образцов показала, что содержание генов в контрольной группе было более разнообразным, в то время как образцы PPA группировались вместе. Кластеризация по содержанию генов была сопоставима с кластеризацией по видовому составу. Таким образом, различия в обилии метаболических путей согласуются с изменениями в обилии конкретных видов и штаммов внутри них. В образцах PPA два метаболических пути со значительно более высоким содержанием были связаны с метаболизмом аминосахаров/нуклеотидных сахаров (ko:K21279) и множественными путями метаболизма липидов (ko:K00647, ko:K03801; дополнительная таблица 3). Гены, связанные с ko:K21279, как известно, связаны с родом Bacteroides, одним из родов со значительно большим количеством видов в образцах PPA. Этот фермент может избегать иммунного ответа, экспрессируя капсульные полисахариды (Wang et al., 2008). Это может объяснить увеличение количества бактерий рода Bacteroidetes, наблюдаемое у мышей, подвергшихся воздействию PPA. Это дополняет повышенный синтез жирных кислот, наблюдаемый в микробиоме, подвергшемся воздействию PPA. Бактерии используют путь FASIIko:K00647 (fabB) для производства жирных кислот, которые могут влиять на метаболические пути хозяина (Yao and Rock, 2015; Johnson et al., 2020), а изменения в липидном обмене могут играть роль в нейроразвитии (Yu et al., 2020). Другой путь, демонстрирующий повышенную численность в образцах PPA, — это биосинтез стероидных гормонов (ko:K12343). Все больше данных свидетельствует об обратной зависимости между способностью кишечной микробиоты влиять на уровни гормонов и способностью подвергаться влиянию гормонов, так что повышенные уровни стероидов могут иметь негативные последствия для здоровья (Tetel et al., 2018).
Данное исследование имеет свои ограничения и особенности. Важно отметить, что мы не проводили физиологических исследований животных. Поэтому невозможно сделать прямой вывод о том, связаны ли изменения микробиома с каким-либо заболеванием. Ещё одним важным моментом является то, что мыши в этом исследовании получали тот же рацион, что и их матери. В будущих исследованиях можно будет определить, улучшает ли переход с диеты, богатой ППА, на диету без ППА её воздействие на микробиом. Одним из ограничений нашего исследования, как и многих других, является ограниченный размер выборки. Хотя можно сделать обоснованные выводы, больший размер выборки обеспечил бы большую статистическую мощность при анализе результатов. Мы также с осторожностью относимся к выводам о связи между изменениями кишечного микробиома и каким-либо заболеванием (Yap et al., 2021). Факторы, влияющие на состав микроорганизмов, включая возраст, пол и диету, могут существенно влиять на него. Эти факторы могут объяснить противоречия, наблюдаемые в литературе относительно связи микробиома кишечника со сложными заболеваниями (Johnson et al., 2019; Lagod and Naser, 2023). Например, было показано, что численность представителей рода Bacteroidetes либо увеличивается, либо уменьшается у животных и людей с расстройствами аутистического спектра (Angelis et al., 2013; Kushak et al., 2017). Аналогично, исследования состава кишечника у пациентов с воспалительными заболеваниями кишечника выявили как увеличение, так и уменьшение численности одних и тех же таксонов (Walters et al., 2014; Forbes et al., 2018; Upadhyay et al., 2023). Чтобы ограничить влияние гендерной предвзятости, мы постарались обеспечить равное представительство полов, чтобы различия, скорее всего, были обусловлены диетой. Одной из проблем функциональной аннотации является удаление избыточных последовательностей генов. Наш метод кластеризации генов требует 95% идентичности последовательностей и 85% сходства длин, а также 90% покрытия выравнивания для исключения ложной кластеризации. Однако в некоторых случаях мы наблюдали COG с одинаковыми аннотациями (например, MUT) (рис. 6). Необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить, являются ли эти ортологи различными, связаны ли они с конкретными родами или это является ограничением подхода к кластеризации генов. Еще одним ограничением функциональной аннотации является потенциальная ошибочная классификация; бактериальный ген mmdA является известным ферментом, участвующим в синтезе пропионата, но KEGG не связывает его с метаболическим путем пропионата. В отличие от этого, ортологи scpB и mmcD связаны между собой. Большое количество генов без обозначенных нокаутов может привести к невозможности идентификации генов, связанных с PPA, при оценке количества генов. Будущие исследования выиграют от метатранскриптомного анализа, который может обеспечить более глубокое понимание функциональных характеристик кишечной микробиоты и связать экспрессию генов с потенциальными последующими эффектами. Для исследований, посвященных конкретным нейроразвивающим расстройствам или воспалительным заболеваниям кишечника, необходимы физиологические и поведенческие оценки животных, чтобы связать изменения в составе микробиома с этими расстройствами. Дополнительные исследования по трансплантации кишечного микробиома в безмикробных мышей также были бы полезны для определения того, является ли микробиом движущей силой или характерной чертой заболевания.
В заключение, мы продемонстрировали, что пищевой ППА (пероксидфосфат) влияет на состав кишечной микробиоты. ППА — это одобренный FDA консервант, широко распространенный в различных продуктах питания, который при длительном воздействии может привести к нарушению нормальной кишечной флоры. Мы обнаружили изменения в численности нескольких бактерий, что свидетельствует о том, что ППА может влиять на состав кишечной микробиоты. Изменения в микробиоте могут приводить к изменениям уровней определенных метаболических путей, что, в свою очередь, может вызывать физиологические изменения, имеющие значение для здоровья организма. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить, могут ли эффекты пищевого ППА на состав микробиоты приводить к дисбиозу или другим заболеваниям. Данное исследование закладывает основу для будущих исследований того, как влияние ППА на состав кишечника может сказаться на здоровье человека.
Представленные в данном исследовании наборы данных доступны в онлайн-репозиториях. Название репозитория и идентификационный номер: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA1092431.
Данное исследование на животных было одобрено Комитетом по этике и использованию животных Университета Центральной Флориды (UCF-IACUC) (номер разрешения на использование животных: PROTO202000002). Исследование соответствует местным законам, правилам и требованиям учреждения.
НГ: Концептуализация, подготовка данных, формальный анализ, исследование, методология, программное обеспечение, визуализация, написание (первоначальный вариант), написание (рецензирование и редактирование). ЛА: Концептуализация, подготовка данных, методология, ресурсы, написание (рецензирование и редактирование). ШХ: Формальный анализ, программное обеспечение, написание (рецензирование и редактирование). СА: Исследование, написание (рецензирование и редактирование). Главный судья: Исследование, написание (рецензирование и редактирование). СН: Концептуализация, администрирование проекта, ресурсы, надзор, написание (рецензирование и редактирование). ТА: Концептуализация, администрирование проекта, надзор, написание (рецензирование и редактирование).
Авторы заявляют, что не получали финансовой поддержки для проведения исследования, написания и/или публикации данной статьи.
Авторы заявляют, что исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых связей, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов. Не применимо.
Все мнения, выраженные в этой статье, являются исключительно мнениями авторов и не обязательно отражают взгляды их учреждений, издателей, редакторов или рецензентов. Издатель не гарантирует и не подтверждает достоверность каких-либо продуктов, оцениваемых в этой статье, или заявлений их производителей.
Дополнительные материалы к этой статье можно найти в интернете: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/frmbi.2024.1451735/full#supplementary-material
Абделли Л.С., Самсам А., Нассер С.А. (2019). Пропионовая кислота вызывает глиоз и нейровоспаление путем регуляции пути PTEN/AKT при расстройствах аутистического спектра. Научные отчеты 9, 8824–8824. doi: 10.1038/s41598-019-45348-z
Эйтчисон, Дж. (1982). Статистический анализ композиционных данных. JR Stat Soc Ser B Methodol. 44, 139–160. doi: 10.1111/j.2517-6161.1982.tb01195.x
Ан Дж., Квон Х., Ким Й.Дж. (2023). Соотношение Firmicutes/Bacteroidetes как фактор риска рака молочной железы. Журнал клинической медицины, 12, 2216. doi: 10.3390/jcm12062216
Андерс С., Хубер В. (2010). Анализ дифференциальной экспрессии данных подсчета последовательностей. Nat Prev. 1–1, 1–10. doi: 10.1038/npre.2010.4282.1
Ангелис, М.Д., Пикколо, М., Ваннини, Л., Сирагуса, С., Джакомо, А.Д., Серразанетти, Д.И. и др. (2013). Фекальная микробиота и метаболом у детей с аутизмом и общим расстройством развития, не классифицированным иным образом. PloS One 8, e76993. doi: 10.1371/journal.pone.0076993
Аверина ОВ, Ковтун АС, Полякова СИ, Савилова АМ, Ребриков ДВ, Даниленко ВН (2020). Бактериальные нейрометаболические характеристики кишечной микробиоты у маленьких детей с расстройствами аутистического спектра. Журнал медицинской микробиологии 69, 558–571. doi: 10.1099/jmm.0.001178
Бакеро Ф., Номбела К. (2012). Микробиом как орган человека. Клиническая микробиология и инфекция 18, 2–4. doi: 10.1111/j.1469-0691.2012.03916.x
Баур Т., Дюрре П. (2023). Новые данные о физиологии бактерий, продуцирующих пропионовую кислоту: Anaerotignum propionicum и Anaerotignum neopropionicum (ранее Clostridium propionicum и Clostridium neopropionicum). Микроорганизмы 11, 685. doi: 10.3390/microorganisms11030685
Базер Ф.В., Спенсер Т.Э., Ву Дж., Кадд Т.А., Майнингер С.Дж. (2004). Питание матери и развитие плода. Дж Нутр. 134, 2169–2172. дои: 10.1093/jn/134.9.2169
Бенджамини, Й., и Хохберг, Дж. (1995). Контроль частоты ложноположительных результатов: практичный и эффективный подход к множественному тестированию. JR Stat Soc Ser B Methodol. 57, 289–300. doi: 10.1111/j.2517-6161.1995.tb02031.x
Дата публикации: 18 апреля 2025 г.