Иммуномодулирующие метаболиты являются ключевой особенностью микроокружения опухоли (МОО), но, за редкими исключениями, их идентичность остается в значительной степени неизвестной. В данном исследовании мы проанализировали опухоли и Т-клетки из опухолей и асцита пациентов с высокозлокачественной серозной карциномой (ВЗСК), чтобы выявить метаболом этих различных компартментов МОО. Асцит и опухолевые клетки имеют существенные различия в метаболитах. По сравнению с асцитом, инфильтрирующие опухоль Т-клетки значительно обогащены 1-метилникотинамидом (МНА). Хотя уровень МНА в Т-клетках повышен, экспрессия никотинамид-N-метилтрансферазы (фермента, катализирующего перенос метильных групп от S-аденозилметионина к никотинамиду) ограничена фибробластами и опухолевыми клетками. Функционально МНА индуцирует секрецию Т-клетками цитокина, способствующего развитию опухоли, — фактора некроза опухоли альфа. Таким образом, MNA, продуцируемый микроокружением опухоли, способствует иммунной регуляции Т-клеток и представляет собой потенциальную мишень для иммунотерапии при лечении рака у человека.
Метаболиты, продуцируемые опухолью, могут оказывать сильное ингибирующее воздействие на противоопухолевый иммунитет, и все больше данных свидетельствует о том, что они также могут служить ключевой движущей силой прогрессирования заболевания (1). В дополнение к эффекту Варбурга, в последнее время начали изучать метаболическое состояние опухолевых клеток и его связь с иммунным состоянием микроокружения опухоли (TME). Исследования на мышиных моделях и человеческих Т-клетках показали, что метаболизм глутамина (2), окислительный метаболизм (3) и метаболизм глюкозы (4) могут действовать независимо на различные подгруппы иммунных клеток. Несколько метаболитов в этих путях ингибируют противоопухолевую функцию Т-клеток. Доказано, что блокада кофермента тетрагидробиоптерина (BH4) может повреждать пролиферацию Т-клеток, а увеличение BH4 в организме может усиливать противоопухолевый иммунный ответ, опосредованный CD4 и CD8. Кроме того, иммуносупрессивный эффект кинуренина может быть смягчен введением BH4 (5). При глиобластоме с мутацией изоцитратдегидрогеназы (IDH) секреция энантиометаболического (R)-2-гидроксиглутарата (R-2-HG) ингибирует активацию, пролиферацию и цитолитический эффект Т-клеток (6). Недавно было показано, что метилглиоксаль, побочный продукт гликолиза, продуцируется супрессорными клетками миелоидного происхождения, и перенос метилглиоксаля Т-клетками может ингибировать функцию эффекторных Т-клеток. В лечении нейтрализация метилглиоксаля может преодолеть активность миелоидных супрессорных клеток (MDSC) и синергически усилить терапию блокадой контрольных точек в моделях на мышах (7). Эти исследования в совокупности подчеркивают ключевую роль метаболитов, продуцируемых микроокружением опухоли, в регуляции функции и активности Т-клеток.
Дисфункция Т-клеток широко описана при раке яичников (8). Это частично связано с метаболическими особенностями, присущими гипоксии и аномальной сосудистой сети опухоли (9), что приводит к превращению глюкозы и триптофана в побочные продукты, такие как молочная кислота и кинуренин. Избыток внеклеточного лактата снижает выработку интерферона-γ (ИФН-γ) и стимулирует дифференцировку миелосупрессивных подгрупп (10, 11). Потребление триптофана напрямую ингибирует пролиферацию Т-клеток и подавляет передачу сигналов рецептора Т-клеток (12-14). Несмотря на эти наблюдения, большая часть исследований, посвященных иммунному метаболизму, проводилась в культуре Т-клеток in vitro с использованием оптимизированных сред или ограничивалась гомологичными моделями мышей in vivo, ни одна из которых не отражает в полной мере гетерогенность раковых заболеваний человека и физиологическую макро- и микросреду.
Общей чертой рака яичников является распространение в брюшину и появление асцита. Накопление клеточной жидкости в асците связано с прогрессированием заболевания и плохим прогнозом (15). Согласно сообщениям, это уникальное пространство гипоксично, имеет высокие уровни фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и индоламин-2,3-диоксигеназы (IDO) и инфильтрировано регуляторными Т-клетками и миелоидными ингибиторными клетками (15-18). Метаболическая среда асцита может отличаться от среды самой опухоли, поэтому перепрограммирование Т-клеток в брюшной полости остается неясным. Кроме того, ключевые различия и гетерогенность между асцитом и метаболитами, присутствующими в опухолевой среде, могут препятствовать инфильтрации иммунных клеток и их функции в отношении опухолей, поэтому необходимы дальнейшие исследования.
Для решения этих проблем мы разработали чувствительный метод разделения клеток и жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией (LC-MS/MS) для изучения различных типов клеток (включая CD4+ и CD8+ Т-клетки), а также метаболитов внутри и между опухолями, охватывающих клетки в одной и той же асцитической жидкости и опухолевой среде пациента. Мы используем этот метод в сочетании с высокоразмерной проточной цитометрией и секвенированием РНК отдельных клеток (scRNA-seq) для получения высокоточной картины метаболического статуса этих ключевых популяций. Этот метод выявил значительное увеличение уровня 1-метилникотинамида (MNA) в опухолевых Т-клетках, а эксперименты in vitro показали, что иммуномодулирующее действие MNA на функцию Т-клеток ранее не было известно. В целом, этот метод выявляет взаимные метаболические взаимодействия между опухолями и иммунными клетками и предоставляет уникальные данные о метаболитах, регулирующих иммунный ответ, что может быть полезно для лечения рака яичников с помощью Т-клеточной иммунотерапии.
Мы использовали высокоразмерную проточную цитометрию для одновременного количественного определения поглощения глюкозы [2-(N-(7-нитрофенил-2-окса-1,3-диаза-4-ил)амино)-2-дезоксиглюкозы (2-NBDG) и митохондриальной активности [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) — типичных маркеров, позволяющих различать популяции иммунных клеток и опухолевых клеток (таблица S2 и рисунок S1A). Этот анализ показал, что по сравнению с Т-клетками, клетки асцита и опухоли имеют более высокие уровни поглощения глюкозы, но меньшие различия в митохондриальной активности. Среднее поглощение глюкозы опухолевыми клетками [CD45-EpCAM (EpCAM)+] в три-четыре раза выше, чем у Т-клеток, а среднее поглощение глюкозы Т-клетками CD4+ в 1,2 раза выше, чем у Т-клеток CD8+, что указывает на то, что инфильтрирующие опухоль лимфоциты (TIL) имеют разные метаболические потребности даже в одном и том же микроокружении опухоли (рис. 1А). В отличие от этого, митохондриальная активность в опухолевых клетках аналогична активности Т-клеток CD4+, и митохондриальная активность обоих типов клеток выше, чем у Т-клеток CD8+ (рис. 1B). В целом, эти результаты отражают уровень метаболизма. Метаболическая активность опухолевых клеток выше, чем у Т-клеток CD4+, а метаболическая активность Т-клеток CD4+ выше, чем у Т-клеток CD8+. Несмотря на эти различия между типами клеток, не наблюдается существенной разницы в метаболическом статусе Т-клеток CD4+ и CD8+ или их относительном соотношении в асците по сравнению с опухолями (рис. 1C). Напротив, во фракции клеток CD45 доля клеток EpCAM+ в опухоли увеличилась по сравнению с асцитом (рис. 1D). Мы также наблюдали явное метаболическое различие между компонентами клеток EpCAM+ и EpCAM-. Клетки EpCAM+ (опухолевые) обладают более высоким поглощением глюкозы и митохондриальной активностью, чем клетки EpCAM-, которая значительно выше метаболической активности фибробластов в опухолевых клетках в микроокружении опухоли (рис. 1, E и F).
(A и B) Медианная интенсивность флуоресценции (MFI) поглощения глюкозы (2-NBDG) (A) и митохондриальная активность CD4+ Т-клеток (MitoTracker темно-красный) (B) Репрезентативные графики (слева) и табличные данные (справа), CD8+ Т-клетки и EpCAM+ CD45-опухолевые клетки из асцита и опухоли. (C) Соотношение CD4+ и CD8+ клеток (CD3+ Т-клеток) в асците и опухоли. (D) Доля EpCAM+ опухолевых клеток в асците и опухоли (CD45−). (E и F) Поглощение глюкозы (2-NBDG) EpCAM+ CD45-опухолевыми клетками и EpCAM-CD45-матриксом (E) и митохондриальная активность (MitoTracker темно-красный) (F) Репрезентативные графики (слева) и табличные данные (справа) Асцит и опухолевые клетки. (G) Репрезентативные графики экспрессии CD25, CD137 и PD1, полученные методом проточной цитометрии. (H и I) Экспрессия CD25, CD137 и PD1 на CD4+ Т-клетках (H) и CD8+ Т-клетках (I). (J и K) Фенотипы наивных, центральных клеток памяти (Tcm), эффекторных (Teff) и эффекторных клеток памяти (Tem) на основе экспрессии CCR7 и CD45RO. Репрезентативные изображения (слева) и табличные данные (справа) CD4+ Т-клеток (J) и CD8+ Т-клеток (K) в асците и опухолях. Значения P определены с помощью парного t-критерия (*P<0,05, **P<0,01 и ***P<0,001). Линия представляет подобранных пациентов (n = 6). FMO, флуоресценция минус один; MFI, медианная интенсивность флуоресценции.
Дальнейший анализ выявил другие существенные различия между высокоразрешенным фенотипическим статусом Т-клеток. Активированные (рис. 1, G–I) и эффекторные клетки памяти (рис. 1, J и K) в опухолях встречаются гораздо чаще, чем в асците (доля CD3+ Т-клеток). Аналогично, анализ фенотипа по экспрессии маркеров активации (CD25 и CD137) и маркеров истощения [белок запрограммированной клеточной смерти 1 (PD1)] показал, что, хотя метаболические характеристики этих популяций различаются (рис. S1, B–E), существенных метаболических различий между наивными, эффекторными и клетками памяти последовательно не наблюдалось (рис. S1, F–I). Эти результаты были подтверждены с помощью методов машинного обучения для автоматического присвоения фенотипов клеток (21), что дополнительно выявило наличие большого количества клеток костного мозга (CD45+/CD3-/CD4+/CD45RO+) в асците пациента (рис. S2A). Среди всех идентифицированных типов клеток эта популяция миелоидных клеток продемонстрировала самое высокое поглощение глюкозы и митохондриальную активность (рисунок S2, B-G). Эти результаты подчеркивают существенные метаболические различия между множеством типов клеток, обнаруженных в асците и опухолях у пациентов с высокозлокачественной серозной карциномой яичников.
Основная проблема в понимании метабономических характеристик Т-лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль (TIL), заключается в необходимости выделения образцов Т-клеток достаточной чистоты, качества и количества из опухолей. Недавние исследования показали, что методы сортировки и обогащения с помощью шариков на основе проточной цитометрии могут приводить к изменениям в профилях клеточных метаболитов (22-24). Для решения этой проблемы мы оптимизировали метод обогащения с помощью шариков для выделения и изоляции TIL из хирургически удаленных опухолей яичников человека перед анализом методом ЖХ-МС/МС (см. Материалы и методы; Рисунок 2А). Чтобы оценить общее влияние этого протокола на изменения метаболитов, мы сравнили профили метаболитов Т-клеток, активированных здоровыми донорами после вышеуказанного этапа разделения с помощью шариков, с клетками, которые не были разделены с помощью шариков, а оставались на льду. Этот анализ контроля качества показал высокую корреляцию между этими двумя условиями (r = 0,77), а техническая воспроизводимость группы из 86 метаболитов обладает высокой воспроизводимостью (Рисунок 2B). Таким образом, эти методы позволяют проводить точный анализ метаболитов в клетках, подвергающихся обогащению по типу клеток, предоставляя первую высокоразрешающую платформу для идентификации специфических метаболитов в HGSC, что позволяет глубже понять специфичность клеточной программы полового метаболизма.
(A) Схема обогащения с помощью магнитных шариков. Перед анализом методом ЖХ-МС/МС клетки проходят три последовательных раунда обогащения с помощью магнитных шариков или остаются на льду. (B) Влияние типа обогащения на количество метаболитов. Среднее значение трех измерений для каждого типа обогащения ± стандартная ошибка. Серая линия представляет собой соотношение 1:1. Внутриклассовая корреляция (ICC) повторных измерений показана в подписи к оси. NAD, никотинамидадениндинуклеотид. (C) Схема рабочего процесса анализа метаболитов у пациентов. Асцитная жидкость или опухоли собираются у пациентов и криоконсервируются. Небольшая часть каждого образца анализируется методом проточной цитометрии, в то время как оставшиеся образцы проходят три раунда обогащения для клеток CD4+, CD8+ и CD45-. Эти клеточные фракции анализируются с помощью ЖХ-МС/МС. (D) Тепловая карта стандартизированного количества метаболитов. Дендрограмма представляет собой кластеризацию Уорда евклидовых расстояний между образцами. (E) Анализ главных компонентов (PCA) карты метаболитов образца, показывающий три повтора каждого образца; образцы от одного и того же пациента соединены линией. (F) PCA профиля метаболитов образца с учетом пациента (т.е. с использованием частичной избыточности); тип образца ограничен выпуклой оболочкой. PC1, главный компонент 1; PC2, главный компонент 2.
Далее мы применили этот метод обогащения для анализа 99 метаболитов во фракциях клеток CD4+, CD8+ и CD45- в первичном асците и опухолях шести пациентов с HGSC (рисунок 2C, рисунок S3A и таблицы S3 и S4). Интересующая нас популяция составляет от 2% до 70% от исходной большой выборки живых клеток, и доля клеток значительно варьируется между пациентами. После разделения с помощью микросфер обогащенная интересующая нас фракция (CD4+, CD8+ или CD45-) в среднем составляет более 85% всех живых клеток в образце. Этот метод обогащения позволяет нам анализировать популяции клеток из метаболизма тканей опухолей человека, что невозможно сделать на больших образцах. Используя этот протокол, мы определили, что l-кинуренин и аденозин, эти два хорошо изученных иммуносупрессивных метаболита, были повышены в опухолевых Т-клетках или опухолевых клетках (рисунок S3, B и C). Таким образом, полученные результаты демонстрируют точность и способность нашей технологии разделения клеток и масс-спектрометрии обнаруживать биологически важные метаболиты в тканях пациентов.
Наш анализ также выявил выраженное метаболическое разделение типов клеток внутри и между пациентами (рис. 2D и рис. S4A). В частности, по сравнению с другими пациентами, у пациента 70 наблюдались иные метаболические характеристики (рис. 2E и рис. S4B), что указывает на возможную существенную метаболическую гетерогенность между пациентами. Стоит отметить, что по сравнению с другими пациентами (1,2–2 литра; таблица S1) общее количество асцитической жидкости, собранной у пациента 70 (80 мл), было меньше. Контроль межпациентной гетерогенности в ходе анализа главных компонентов (например, с использованием анализа частичной избыточности) показывает согласованные изменения между типами клеток, а типы клеток и/или микроокружение четко агрегированы в соответствии с метаболическим профилем (рис. 2F). Анализ отдельных метаболитов подчеркнул эти эффекты и выявил значительные различия между типами клеток и микроокружением. Стоит отметить, что наиболее выраженное различие наблюдается в отношении MNA, который обычно обогащен в клетках CD45- и в клетках CD4+ и CD8+, инфильтрирующих опухоль (рис. 3А). Для клеток CD4+ этот эффект наиболее очевиден, и содержание MNA в клетках CD8+ также, по-видимому, сильно зависит от окружающей среды. Однако это не имеет значения, поскольку только у трех из шести пациентов можно оценить показатели CD8+ опухоли. Помимо MNA, в различных типах клеток в асците и опухолях также наблюдается различное содержание других метаболитов, которые плохо изучены в Т-лимфоцитах, инфильтрирующих опухоль (рис. S3 и S4). Таким образом, эти данные указывают на перспективный набор иммуномодулирующих метаболитов для дальнейших исследований.
(A) Нормализованное содержание MNA в клетках CD4+, CD8+ и CD45- из асцита и опухоли. На диаграмме размаха показаны медиана (линия), межквартильный размах (перегиб рамки) и диапазон данных, до 1,5-кратного межквартильного размаха (усы рамки). Как описано в разделе «Материалы и методы для пациентов», для определения значения P используйте значение limma пациента (*P<0,05 и **P<0,01). (B) Схематическая диаграмма метаболизма MNA (60). Метаболиты: S-аденозил-1-метионин; SAH, S-аденозин-1-гомоцистеин; NA, никотинамид; MNA, 1-метилникотинамид; 2-PY, 1-метил-2-пиридон-5-карбоксамид; 4-PY, 1-метил-4-пиридон-5-карбоксамид; NR, никотинамид рибоза; (C) t-SNE scRNA-seq асцитной жидкости (серый) и опухоли (красный; n = 3 пациента). (D) Экспрессия NNMT в различных клеточных популяциях, идентифицированных с помощью scRNA-seq. (E) Экспрессия NNMT и AOX1 в клетках SK-OV-3, клетках эмбриональной почки человека (HEK) 293T, Т-клетках и Т-клетках, обработанных MNA. Показана свернутая экспрессия относительно SK-OV-3. (F) Экспрессия SLC22A1 и SLC22A2 в клетках SK-OV-3, HEK293T, Т-клетках и Т-клетках, обработанных 8 мМ MNA. Показана свернутая экспрессия относительно SK-OV-3. Показана экспрессия с помощью SEM (n = 6 здоровых доноров). Значения Ct > 35 считаются неопределяемыми (UD). (G) Содержание MNA в активированных Т-клетках здоровых доноров после 72 часов инкубации с MNA. Показана экспрессия с помощью SEM (n = 4 здоровых донора).
MNA образуется путем переноса метильной группы от S-аденозил-1-метионина (SAM) к никотинамиду (NA) с помощью никотинамид-N-метилтрансферазы (NNMT; рис. 3B). NNMT сверхэкспрессируется при различных видах рака человека и связана с пролиферацией, инвазией и метастазированием (25-27). Чтобы лучше понять источник MNA в Т-клетках в микроокружении опухоли, мы использовали scRNA-seq для характеристики экспрессии NNMT в различных типах клеток в асците и опухолях трех пациентов с HGSC (табл. S5). Анализ примерно 6500 клеток показал, что в асците и опухолевой среде экспрессия NNMT была ограничена предполагаемыми популяциями фибробластов и опухолевых клеток (рис. 3, C и D). Стоит отметить, что в любой популяции, экспрессирующей PTPRC (CD45+), отсутствует явная экспрессия NNMT (рисунок 3D и рисунок S5A), что указывает на то, что MNA, обнаруженный в спектре метаболитов, был введен в Т-клетки. Экспрессия альдегидоксидазы 1 (AOX1), превращающей MNA в 1-метил-2-пиридон-5-карбоксамид (2-PYR) или 1-метил-4-пиридон-5-карбоксамид (4-PYR); рисунок 3B) также ограничена популяцией фибробластов, экспрессирующих COL1A1 (рисунок S5A), что в совокупности указывает на то, что Т-клетки не обладают способностью к обычному метаболизму MNA. Характер экспрессии этих генов, связанных с MNA, был подтвержден с использованием второго независимого набора клеточных данных из асцитической жидкости пациентов с HGSC (рисунок S5B; n = 6) (16). Кроме того, количественный анализ полимеразной цепной реакции (кПЦР) Т-клеток здоровых доноров, обработанных MNA, показал, что по сравнению с контрольными клетками опухоли яичника SK-OV-3 экспрессия NNMT или AOX1 практически отсутствовала (рисунок 3E). Эти неожиданные результаты указывают на то, что MNA может секретироваться фибробластами или опухолями в соседние Т-клетки в микроокружении опухоли.
Хотя кандидатами являются семейство органических катионных транспортеров 1–3 (OCT1, OCT2 и OCT3), кодируемых семейством растворимых переносчиков 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 и SLC22A3), потенциальные транспортеры MNA до сих пор не определены (28). Количественная ПЦР мРНК из Т-клеток здоровых доноров показала низкий уровень экспрессии SLC22A1, но неопределяемый уровень SLC22A2, что подтвердило ранее опубликованные данные (рис. 3F) (29). В отличие от этого, клеточная линия опухоли яичника SK-OV-3 экспрессировала высокие уровни обоих транспортеров (рис. 3F).
Для проверки возможности поглощения чужеродного MNA Т-клетками, Т-клетки здоровых доноров культивировали в течение 72 часов в присутствии различных концентраций MNA. В отсутствие экзогенного MNA клеточное содержание MNA не обнаруживалось (рис. 3G). Однако активированные Т-клетки, обработанные экзогенным MNA, показали дозозависимое увеличение содержания MNA в клетках до 6 мМ MNA (рис. 3G). Этот результат указывает на то, что, несмотря на низкий уровень экспрессии транспортера и отсутствие основного фермента, ответственного за внутриклеточный метаболизм MNA, Т-лимфоциты, инфильтрирующие опухоль (TIL), все же способны поглощать MNA.
Спектр метаболитов в Т-клетках пациентов и эксперименты по абсорбции МНА in vitro повышают вероятность того, что ассоциированные с раком фибробласты (АРФ) секретируют МНА, а опухолевые клетки могут регулировать фенотип и функцию Т-лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль (ТЛИ). Для определения влияния МНА на Т-клетки, Т-клетки здоровых доноров активировали in vitro в присутствии или отсутствии МНА, и оценивали их пролиферацию и продукцию цитокинов. После 7 дней добавления МНА в самой высокой дозе количество удвоений популяции умеренно снизилось, в то время как жизнеспособность сохранялась при всех дозах (рис. 4А). Кроме того, обработка экзогенным МНА привела к увеличению доли CD4+ и CD8+ Т-клеток, экспрессирующих фактор некроза опухоли-α (ФНОα; рис. 4B). В отличие от этого, внутриклеточная продукция ИФН-γ была значительно снижена в CD4+ Т-клетках, но не в CD8+ Т-клетках, и не наблюдалось значительных изменений в интерлейкине-2 (ИЛ-2; рис. 4, C и D). Таким образом, иммуноферментный анализ (ELISA) супернатантов из культур Т-клеток, обработанных MNA, показал значительное увеличение TNFα, снижение IFN-γ и отсутствие изменений в IL-2 (рисунок 4, E-G). Снижение IFN-γ указывает на то, что MNA может играть роль в ингибировании противоопухолевой активности Т-клеток. Для моделирования эффекта MNA на цитотоксичность, опосредованную Т-клетками, химерные антигенные рецепторы Т (FRα-CAR-T), нацеленные на фолатный рецептор α, и CAR-T (GFP), регулируемые зеленым флуоресцентным белком (GFP-CAR-T), были получены из мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) здоровых доноров. CAR-T-клетки культивировали в течение 24 часов в присутствии MNA, а затем совместно культивировали с клетками опухоли яичника человека SK-OV-3, экспрессирующими рецептор фолата α, в соотношении эффекторных клеток к клеткам-мишеням 10:1. Обработка MNA привела к значительному снижению цитотоксической активности FRα-CAR-T-клеток, аналогичному активности FRα-CAR-T-клеток, обработанных аденозином (рисунок 4H).
(A) Общее количество жизнеспособных клеток и удвоение популяции (PD) непосредственно из культуры на 7-й день. Гистограмма представляет среднее значение + стандартная ошибка среднего (SEM) для шести здоровых доноров. Представлены данные как минимум из n = 3 независимых экспериментов. (B-D) CD3/CD28 и IL-2 использовались для активации Т-клеток в соответствующих концентрациях MNA в течение 7 дней. Перед анализом клетки стимулировали PMA/иономицином с GolgiStop в течение 4 часов. Экспрессия TNFα (B) в Т-клетках. Пример изображения (слева) и табличные данные (справа) экспрессии TNFα в живых клетках. Экспрессия IFN-γ (C) и IL-2 (D) в Т-клетках. Экспрессию цитокинов измеряли методом проточной цитометрии. Гистограмма представляет среднее значение (n = 6 здоровых доноров) + стандартная ошибка среднего (SEM). Для определения значения P использовали однофакторный дисперсионный анализ и повторные измерения (*P<0,05 и **P<0,01). Представлены данные как минимум из n = 3 независимых экспериментов. (E-G) CD3/CD28 и IL-2 использовались для активации Т-клеток в соответствующих концентрациях MNA в течение 7 дней. Среда собиралась до и после 4 часов стимуляции PMA/иономицином. Концентрации TNFα (E), IFN-γ (F) и IL-2 (G) измерялись методом ELISA. Гистограмма представляет среднее значение (n = 5 здоровых доноров) + стандартная ошибка среднего. Значение P определялось с помощью однофакторного дисперсионного анализа и повторных измерений (*P<0,05). Пунктирная линия указывает предел обнаружения. (H) Анализ лизиса клеток. Клетки FRα-CAR-T или GFP-CAR-T обрабатывались аденозином (250 мкМ) или MNA (10 мМ) в течение 24 часов или оставались необработанными (Ctrl). Измерялся процент гибели клеток SK-OV-3. Значение p определялось с помощью t-критерия Уэлча (*P<0,5 и **P<0,01).
Для получения механистического понимания MNA-зависимой регуляции экспрессии TNFα были оценены изменения мРНК TNFα в Т-клетках, обработанных MNA (рисунок 5A). Т-клетки здоровых доноров, обработанные MNA, показали двукратное увеличение уровня транскрипции TNFα, что указывает на зависимость MNA от регуляции транскрипции TNFα. Для исследования этого возможного механизма регуляции были оценены два известных транскрипционных фактора, регулирующих TNFα, а именно активированный ядерный фактор Т-клеток (NFAT) и специфический белок 1 (Sp1), в ответ на связывание MNA с проксимальным промотором TNFα (30). Промотор TNFα содержит 6 идентифицированных сайтов связывания NFAT и 2 сайта связывания Sp1, перекрывающихся в одном сайте [-55 пар оснований (п.о.) от 5'-кэпа] (30). Хроматиновая иммунопреципитация (ChIP) показала, что при обработке MNA связывание Sp1 с промотором TNFα увеличилось в три раза. Включение NFAT также увеличилось и приблизилось к значимости (рисунок 5B). Эти данные указывают на то, что MNA регулирует экспрессию TNFα посредством транскрипции Sp1 и, в меньшей степени, экспрессию NFAT.
(A) По сравнению с Т-клетками, культивированными без MNA, показано изменение уровня экспрессии TNFα в Т-клетках, обработанных MNA. Представлена ​​картина экспрессии со стандартной ошибкой среднего (n = 5 здоровых доноров). Данные получены как минимум из n = 3 независимых экспериментов. (B) Промотор TNFα в Т-клетках, обработанных 8 мМ MNA или без него, после комбинированной обработки NFAT и Sp1 с (Ctrl) и стимуляцией PMA/иономицином в течение 4 часов. В качестве отрицательного и положительного контролей для иммунопреципитации использовались иммуноглобулины G (IgG) и H3 соответственно. Количественная оценка ChIP показала, что связывание Sp1 и NFAT с промотором TNFα в клетках, обработанных MNA, увеличилось в несколько раз по сравнению с контролем. Данные получены как минимум из n = 3 независимых экспериментов. Значение P определено с помощью множественного t-теста (*** P <0,01). (C) По сравнению с асцитом при высокозлокачественной серозной карциноме яичников (ВЗСК), Т-клетки (нецитотоксические) показали повышенную экспрессию ФНО в опухоли. Цвета представляют разных пациентов. Представленные клетки были случайным образом отобраны из 300 и смещены для ограничения перерисовки (** Padj = 0,0076). (D) Предложенная модель МНА для рака яичников. МНА продуцируется в опухолевых клетках и фибробластах в микроокружении опухоли и поглощается Т-клетками. МНА увеличивает связывание Sp1 с промотором ФНОα, что приводит к увеличению транскрипции ФНОα и продукции цитокина ФНОα. МНА также вызывает снижение уровня ИФН-γ. Ингибирование функции Т-клеток приводит к снижению цитотоксической способности и ускоренному росту опухоли.
Согласно сообщениям, TNFα обладает противоопухолевым и противоопухолевым действием, зависящим от передней и задней части тела, но также играет важную роль в стимулировании роста и метастазирования рака яичников (31-33). По данным исследований, концентрация TNFα в асцитической жидкости и опухолевой ткани у пациентов с раком яичников выше, чем в доброкачественных тканях (34-36). Что касается механизма действия, TNFα может регулировать активацию, функцию и пролиферацию белых кровяных клеток, а также изменять фенотип раковых клеток (37, 38). В соответствии с этими данными, анализ дифференциальной экспрессии генов показал, что экспрессия TNF была значительно повышена в Т-клетках в опухолевой ткани по сравнению с асцитической жидкостью (рисунок 5C). Увеличение экспрессии TNF было очевидно только в популяциях Т-клеток с нецитотоксическим фенотипом (рисунок S5A). В целом, эти данные подтверждают точку зрения о том, что MNA обладает двойным иммуносупрессивным и опухолестимулирующим действием при высокозлокачественной серозной карциноме яичников.
Флуоресцентная маркировка на основе проточной цитометрии стала основным методом изучения метаболизма Т-лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль (TIL). Эти исследования показали, что по сравнению с лимфоцитами периферической крови или Т-клетками из вторичных лимфоидных органов, мышиные и человеческие TIL имеют более высокую склонность к поглощению глюкозы (4, 39) и постепенной потере митохондриальной функции (19, 40). Хотя в данном исследовании мы наблюдали аналогичные результаты, ключевым направлением является сравнение метаболизма опухолевых клеток и TIL из одной и той же резецированной опухолевой ткани. В соответствии с некоторыми из этих предыдущих отчетов, опухолевые клетки (CD45-EpCAM+) из асцита и опухолей имеют более высокое поглощение глюкозы, чем CD8+ и CD4+ Т-клетки, что подтверждает возможность сравнения высокого поглощения глюкозы опухолевыми клетками с Т-клетками. Концепция конкуренции Т-клеток. Однако митохондриальная активность опухолевых клеток выше, чем у CD8+ Т-клеток, но аналогична активности CD4+ Т-клеток. Эти результаты подтверждают формирующуюся тенденцию о важности окислительного метаболизма для опухолевых клеток (41, 42). Они также предполагают, что CD8+ Т-клетки могут быть более восприимчивы к окислительной дисфункции, чем CD4+ Т-клетки, или что CD4+ Т-клетки могут использовать другие источники углерода, помимо глюкозы, для поддержания митохондриальной активности (43, 44). Следует отметить, что мы не наблюдали различий в поглощении глюкозы или митохондриальной активности между эффекторными CD4+ Т-клетками, эффекторными Т-клетками памяти и центральными Т-клетками памяти в асците. Аналогично, состояние дифференцировки CD8+ Т-клеток в опухолях не связано с изменениями в поглощении глюкозы, что подчеркивает значительную разницу между Т-клетками, культивируемыми in vitro, и Т-лимфоцитами, инфильтрирующими опухоль человека, in vivo (22). Эти наблюдения также были подтверждены использованием непредвзятого автоматического распределения клеточных популяций, которое дополнительно показало, что клетки CD45+/CD3-/CD4+/CD45RO+ с более высоким поглощением глюкозы и митохондриальной активностью, чем опухолевые клетки, преобладают, но имеют метаболически активную клеточную популяцию. Эта популяция может представлять собой предполагаемую субпопуляцию миелоидных супрессорных клеток или плазмоцитоидных дендритных клеток, идентифицированных в анализе scRNA-seq. Хотя оба этих типа клеток были обнаружены в опухолях яичников человека [45], они все еще нуждаются в дальнейшей работе для описания этой миелоидной субпопуляции.
Хотя методы, основанные на проточной цитометрии, могут прояснить общие различия в метаболизме глюкозы и окислительном метаболизме между типами клеток, точные метаболиты, продуцируемые глюкозой или другими источниками углерода для митохондриального метаболизма в микроокружении опухоли, еще не определены. Определение наличия или отсутствия метаболитов в определенной субпопуляции Т-лимфоцитов требует очистки клеточной популяции из удаленной ткани. Поэтому наш метод обогащения клеток в сочетании с масс-спектрометрией может дать представление о метаболитах, которые по-разному обогащены в Т-клетках и популяциях опухолевых клеток в соответствующих образцах пациентов. Хотя этот метод имеет преимущества перед флуоресцентной сортировкой клеток, некоторые библиотеки метаболитов могут быть затронуты из-за присущей им стабильности и/или высокой скорости обновления (22). Тем не менее, наш метод смог идентифицировать два известных иммуносупрессивных метаболита, аденозин и кинуренин, поскольку они сильно различаются между типами образцов.
Наш метабономический анализ опухолей и подтипов Т-лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль (ТЛИ), позволяет глубже понять роль метаболитов в микроокружении опухоли яичников. Во-первых, с помощью проточной цитометрии мы определили отсутствие различий в митохондриальной активности между опухолями и CD4+ Т-клетками. Однако анализ LC-MS/MS выявил значительные изменения в количестве метаболитов среди этих популяций, что указывает на необходимость тщательной интерпретации выводов о метаболизме ТЛИ и их общей метаболической активности. Во-вторых, MNA является метаболитом с наибольшими различиями между CD45-клетками и Т-клетками в асците, а не в опухолях. Следовательно, компартментализация и локализация опухоли могут по-разному влиять на метаболизм ТЛИ, что подчеркивает возможную гетерогенность в данной микросреде. В-третьих, экспрессия фермента NNMT, продуцирующего MNA, в основном ограничена фибробластами, ассоциированными с раком (CAF), которые в меньшей степени являются опухолевыми клетками, но определяемые уровни MNA наблюдаются в Т-клетках, происходящих из опухоли. Избыточная экспрессия NNMT в фибробластах яичников, ассоциированных с раком (CAF), имеет известный канцерогенный эффект, частично обусловленный усилением метаболизма CAF, инвазией опухоли и метастазированием (27). Хотя общий уровень TIL умеренный, экспрессия NNMT в CAF тесно связана с мезенхимальным подтипом по данным Атласа генома рака (TCGA), который ассоциируется с плохим прогнозом (27, 46, 47). Наконец, экспрессия фермента AOX1, ответственного за деградацию MNA, также ограничена популяцией CAF, что указывает на отсутствие у Т-клеток способности метаболизировать MNA. Эти результаты подтверждают идею о том, что, хотя для подтверждения этого вывода необходимы дальнейшие исследования, высокие уровни MNA в Т-клетках могут указывать на наличие иммуносупрессивной микросреды CAF.
Учитывая низкий уровень экспрессии транспортеров MNA и неопределяемые уровни ключевых белков, участвующих в метаболизме MNA, присутствие MNA в Т-клетках является неожиданным. Ни NNMT, ни AOX1 не были обнаружены с помощью анализа scRNA-seq и целевой qPCR в двух независимых группах. Эти результаты указывают на то, что MNA не синтезируется Т-клетками, а абсорбируется из окружающей микросреды опухоли. Эксперименты in vitro показывают, что Т-клетки склонны к накоплению экзогенного MNA.
Наши исследования in vitro показали, что экзогенный MNA индуцирует экспрессию TNFα в Т-клетках и усиливает связывание Sp1 с промотором TNFα. Хотя TNFα обладает как противоопухолевыми, так и антиопухолевыми функциями, при раке яичников TNFα может способствовать росту опухоли (31-33). Нейтрализация TNFα в культуре клеток опухоли яичников или устранение сигнала TNFα в моделях на мышах может улучшить опосредованную TNFα продукцию воспалительных цитокинов и ингибировать рост опухоли (32, 35). Следовательно, в этом случае MNA, продуцируемый микроокружением опухоли, может действовать как провоспалительный метаболит посредством TNFα-зависимого механизма через аутокринную петлю, тем самым способствуя возникновению и распространению рака яичников (31). Исходя из этой возможности, блокада TNFα изучается как потенциальное терапевтическое средство при раке яичников (37, 48, 49). Кроме того, MNA снижает цитотоксичность CAR-T-клеток по отношению к клеткам опухоли яичника, что является дополнительным доказательством иммуносупрессии, опосредованной MNA. В совокупности эти результаты предполагают модель, в которой опухоли и клетки CAF секретируют MNA во внеклеточное микроокружение опухоли. Благодаря (i) стимуляции роста рака яичника, индуцированной TNF, и (ii) ингибированию цитотоксической активности Т-клеток, индуцированному MNA, это может оказывать двойное противоопухолевое действие (рисунок 5D).
В заключение, благодаря применению комбинации методов быстрого обогащения клеток, секвенирования отдельных клеток и метаболического профилирования, данное исследование выявило огромные иммунометаболомные различия между опухолевыми клетками и клетками асцита у пациентов с высокозлокачественной серозной карциномой яичников (ВЗСК). Этот всесторонний анализ показал наличие различий в поглощении глюкозы и митохондриальной активности между Т-клетками, а также идентифицировал MNA как неклеточно-автономный иммунорегуляторный метаболит. Эти данные имеют значение для понимания того, как микроокружение опухоли влияет на метаболизм Т-клеток при раке человека. Хотя сообщалось о прямой конкуренции за питательные вещества между Т-клетками и раковыми клетками, метаболиты также могут выступать в качестве косвенных регуляторов, способствуя прогрессированию опухоли и, возможно, подавляя эндогенные иммунные ответы. Дальнейшее описание функциональной роли этих регуляторных метаболитов может открыть альтернативные стратегии для усиления противоопухолевого иммунного ответа.
Образцы тканей пациентов и клинические данные были получены из хранилища опухолевой ткани Британской Колумбии, сертифицированного Канадской сетью хранилищ тканей. В соответствии с протоколом, утвержденным Комитетом по этике исследований рака Британской Колумбии и Университетом Британской Колумбии (H07-00463), все образцы тканей и клинические данные пациентов были получены с информированным письменным согласием или с формальным отказом от согласия. Образцы хранятся в сертифицированном Биобанке (BRC-00290). Подробные характеристики пациентов представлены в таблицах S1 и S5. Для криоконсервации скальпель используется для механического разложения образца опухоли пациента, после чего он пропускается через фильтр с порами 100 микрон для получения суспензии отдельных клеток. Асцитическая жидкость пациента центрифугировалась при 1500 об/мин в течение 10 минут при 4°C для осаждения клеток и удаления надосадочной жидкости. Клетки, полученные из опухоли и асцитической жидкости, были криоконсервированы в 50% инактивированной нагреванием сыворотке крови человека группы AB (Sigma-Aldrich), 40% среде RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) и 10% диметилсульфоксиде. Эти консервированные суспензии отдельных клеток были разморожены и использованы для метаболомного анализа и определения метаболитов, описанных ниже.
Полная питательная среда состоит из отфильтрованной через фильтр 0,22 мкм среды RPMI 1640:AimV в соотношении 50:50, дополненной питательной средой RPMI 1640 + 2,05 мМ L-глутамина (Thermo Fisher Scientific), 10% инактивированной нагреванием сыворотки крови человека группы AB (Sigma-Aldrich), 12,5 мМ Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 мМ L-глутамина (Thermo Fisher Scientific), 1 x раствор пенициллина-стрептомицина (PenStrep) (Thermo Fisher Scientific) и 50 мкМ МБ-меркаптоэтанола. Питательная среда AimV (Invitrogen) дополнена 20 мМ Hepes (Thermo Fisher Scientific) и 2 мМ L-глутамина (Thermo Fisher Scientific). Буфер для окрашивания в проточном цитометре состоял из фосфатно-буферного раствора (PBS; Invitrogen), отфильтрованного через фильтр 0,22 мкм, с добавлением 3% инактивированной нагреванием сыворотки крови человека группы AB (Sigma). Буфер для обогащения клеток состоял из PBS, отфильтрованного через фильтр 0,22 мкм, и был дополнен 0,5% инактивированной нагреванием сыворотки крови человека группы AB (Sigma-Aldrich).
В полной культуральной среде при 37°C клетки окрашивали 10 нМ MT DR и 100 мкМ 2-NBDG в течение 30 минут. Затем клетки окрашивали красителем для определения жизнеспособности eF506 при 4°C в течение 15 минут. Суспендировали клетки в FC Block (eBioscience) и Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences), разбавляли в буфере для окрашивания проточного цитометра (согласно инструкциям производителя) и инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре. Окрашивали клетки набором антител (таблица S2) в буфере для окрашивания проточного цитометра при 4°C в течение 20 минут. Суспендировали клетки в буфере для окрашивания проточного цитометра (Cytek Aurora; конфигурация 3L-16V-14B-8R) перед анализом. Для анализа данных о количестве клеток используйте SpectroFlo и FlowJo V10, а для создания данных — GraphPad Prism 8. Медианная интенсивность флуоресценции (MFI) 2-NBDG и MT DR была логарифмически нормализована, а затем для статистического анализа использовался парный t-тест с учетом сопоставления пациентов. Из анализа были удалены все популяции с менее чем 40 событиями; для любых отрицательных значений перед проведением статистического анализа и визуализацией данных введите значение MFI, равное 1.
Чтобы дополнить стратегию ручного гейтирования, описанную выше, мы использовали полную аннотацию дерева ограничения формы (FAUST) (21) для автоматического отнесения клеток к популяции после удаления мертвых клеток в FlowJo. Мы вручную управляем выводом, чтобы объединить популяции, которые, по-видимому, были неправильно распределены (объединение опухолевых клеток PD1+ с опухолевыми клетками PD1-), и сохраненные популяции. Каждый образец содержит в среднем более 2% клеток, всего 11 популяций.
Для разделения мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) от продуктов разделения лейкоцитов использовали центрифугирование в градиенте плотности фиколла (STEMCELL Technologies). CD8+ Т-клетки выделяли из PBMC с помощью микрочастиц CD8 (Miltenyi) и культивировали в полной культуральной среде с использованием TransAct (Miltenyi) в течение 2 недель в соответствии с инструкциями производителя. Клетки выдерживали в течение 5 дней в полной культуральной среде, содержащей IL-7 (10 нг/мл; PeproTech), а затем повторно стимулировали TransAct. На 7-й день, согласно инструкциям производителя, для обогащения клеток использовали микрочастицы CD45 человека (Miltenyi) в трех последовательных циклах. Клетки разделяли на аликвоты для анализа методом проточной цитометрии (как описано выше), и один миллион клеток трижды разделяли на аликвоты для анализа методом ЖХ-МС/МС. Образцы обрабатывали методом ЖХ-МС/МС, как описано ниже. Мы оценивали недостающее значение метаболита с помощью ионов с числом 1000. Каждый образец нормализуется по общему числу ионов (TIC), преобразуется в логарифмическом масштабе и автоматически нормализуется в MetaboAnalystR перед анализом.
Суспензию отдельных клеток каждого пациента размораживали и фильтровали через фильтр с размером пор 40 мкм в полную культуральную среду (как описано выше). В соответствии с протоколом производителя, для обогащения образцов клетками CD8+, CD4+ и CD45- проводили три последовательных раунда положительной селекции с помощью магнитных шариков MicroBeads (Miltenyi) (на льду). Вкратце, клетки ресуспендировали в буфере для обогащения клеток (как описано выше) и подсчитывали. Клетки инкубировали с шариками человеческого CD8, шариками человеческого CD4 или шариками человеческого CD45 (Miltenyi) при 4°C в течение 15 минут, а затем промывали буфером для обогащения клеток. Образец пропускали через колонку LS (Miltenyi), и собирали положительную и отрицательную фракции. Чтобы сократить продолжительность и максимизировать выделение клеток, фракцию CD8 использовали для второго раунда обогащения CD4+, а фракцию CD4 — для последующего обогащения CD45-. В течение всего процесса разделения держите раствор на льду.
Для подготовки образцов для анализа метаболитов клетки промывали один раз ледяным солевым раствором, к каждому образцу добавляли 1 мл 80% метанола, затем перемешивали на вихревом смесителе и быстро замораживали в жидком азоте. Образцы подвергали трем циклам замораживания-оттаивания и центрифугировали при 14 000 об/мин в течение 15 минут при 4°C. Надосадочную жидкость, содержащую метаболиты, выпаривали досуха. Метаболиты растворяли в 50 мкл 0,03% муравьиной кислоты, перемешивали на вихревом смесителе, а затем центрифугировали для удаления осадка.
Извлеките метаболиты, как описано выше. Перенесите надосадочную жидкость в пробирку для высокоэффективной жидкостной хроматографии для метаболомических исследований. Используйте протокол случайной обработки, чтобы обрабатывать каждый образец с одинаковым количеством клеток для предотвращения эффектов партии. Мы провели качественную оценку глобальных метаболитов, ранее опубликованных на тройном квадрупольном масс-спектрометре AB SCIEX QTRAP 5500 (50). Хроматографический анализ и интегрирование площади пиков были выполнены с использованием программного обеспечения MultiQuant версии 2.1 (Applied Biosystems SCIEX).
Для оценки отсутствующего значения метаболита использовалось количество ионов, равное 1000, а TIC каждого образца использовался для расчета нормализованной площади пика каждого обнаруженного метаболита с целью коррекции изменений, внесенных инструментальным анализом при обработке образца. После нормализации TIC используется MetaboAnalystR(51) (параметр по умолчанию) для логарифмического преобразования и автоматического масштабирования линии нормы. Мы использовали PCA с пакетом vegan R для проведения разведочного анализа различий метаболома между типами образцов и использовали анализ частичной избыточности для анализа пациентов. Для построения тепловой карты дендрограммы для кластеризации евклидова расстояния между образцами использовался метод Уорда. Мы использовали limma (52) на стандартизированном содержании метаболитов для идентификации метаболитов с различным содержанием по всем типам клеток и микроокружению. Для упрощения объяснения мы используем параметр среднего значения группы для определения модели и рассматриваем типы клеток в микроокружении как каждую группу (n = 6 групп); Для проверки значимости мы провели три повторных измерения для каждого метаболита. Чтобы избежать ложных воспроизведений, пациент был включен в дизайн limma в качестве препятствия. Для проверки различий в метаболитах между разными пациентами мы скорректировали модель limma, включив пациентов фиксированным образом. Мы сообщаем о значимости заранее заданного контраста между типом клеток и микроокружением Padj <0,05 (поправка Бенджамини-Хохберга).
После обогащения жизнеспособности с использованием набора Miltenyi Dead Cell Removal Kit (>80% жизнеспособности) было проведено секвенирование транскриптома отдельных клеток на замороженных образцах живой асцитической жидкости и опухолей с использованием протокола экспрессии 5'-генов 10x. Было проанализировано пять случаев с совпадающими опухолями и асцитической жидкостью, хотя низкая жизнеспособность одного образца опухоли не позволила включить его в анализ. Для обеспечения множественного отбора пациентов мы объединили образцы каждого пациента в дорожках контроллера 10x хрома и анализировали асцитическую жидкость и опухолевые очаги отдельно. После секвенирования [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp парные концы (PE), геном Квебека; В среднем 73 488 и 41 378 прочтений на клетку для опухоли и асцита соответственно], мы использовали CellSNP и Vireo (53) (на основе CellSNP, поскольку общий человеческий SNP (VCF), предоставленный GRCh38, имеет идентификатор донора. Мы используем SNPRelate для определения наиболее близкого идентичного (IBS) статуса генотипа пациента (IBS), исключая неидентифицированные клетки и клетки, идентифицированные как дуплексы, а также совпадающие доноры между образцами асцита и опухоли (54). На основе этой задачи мы сохранили три случая с обильным клеточным представительством в опухоли и асците для дальнейшего анализа. После выполнения этапа массовой фильтрации в упаковке BioConductor scater (55) и scran (56) было получено 6975 клеток (2792 и 4183 клетки из опухоли и асцита соответственно) для анализа. Мы используем кластеризацию Лувена сети общих ближайших соседей igraph (57). (SNN) на основе расстояния Жаккара для кластеризации клеток по экспрессии. Кластеры были вручную аннотированы в соответствии с предполагаемыми типами клеток на основе экспрессии маркерных генов и визуализированы с помощью t-SNE. Цитотоксические Т-клетки определяются по экспрессии CD8A и GZMA, за исключением субкластеров с низкой экспрессией рибосомальных белков. Мы использовали опубликованные данные Изара и др. (16), включая их встраивание t-SNE, что позволяет контролировать перекрытие экспрессии между маркерами иммунных клеток и экспрессией NNMT.
Клетки периферической крови (PBMC) были отделены от продуктов разделения лейкоцитов (STEMCELL Technologies) методом центрифугирования в градиенте плотности Ficoll. Клетки CD3+ были выделены из PBMC с использованием CD3-шариков (Miltenyi). В присутствии или отсутствии MNA клетки CD3+ были активированы с помощью иммобилизованного на планшете CD3 (5 мкг/мл), растворимого CD28 (3 мкг/мл) и IL-2 (300 Ед/мл; Proleukin). В последний день культивирования жизнеспособность (фиксируемый краситель жизнеспособности eFluor450, eBioscience) и пролиферацию (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) оценивали методом проточной цитометрии. Оценить эффекторную функцию можно путем стимуляции клеток PMA (20 нг/мл) и иономицином (1 мкг/мл) с помощью GolgiStop в течение 4 часов, а также путем мониторинга CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4, BioLegend) и TNFα-флуоресцеин изотиоцианата (FITC) (MAb11, BD). Для qPCR и ChIP клетки стимулируют PMA (20 нг/мл) и иономицином (1 мкг/мл) в течение 4 часов. Супернатант ELISA собирают до и после стимуляции PMA (20 нг/мл) и иономицином (1 мкг/мл) в течение 4 часов.
Для выделения РНК используйте набор RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN) в соответствии с протоколом производителя. Для гомогенизации образца используйте гомогенизатор QIAshredder (QIAGEN). Для синтеза комплементарной ДНК (кДНК) используйте высокопроизводительный набор для синтеза кДНК РНК (Thermo Fisher Scientific). Для количественной оценки экспрессии генов используйте TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) (согласно протоколу производителя) со следующими зондами: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [глицеральдегид-3-фосфат водорода (GAPDH)] и Hs01010726_m1 (SLC22A2). Образцы анализировались на системе ПЦР в реальном времени StepOnePlus (Applied Biosystems) в 96-луночном планшете MicroAmp fast optical (Applied Biosystems) с оптической пленкой MicroAmp. Любое значение Ct, превышающее 35, считается выше порога обнаружения и помечается как необнаружимое.
Проведите ChIP, как описано ранее (58). Вкратце, клетки обрабатывали формальдегидом (конечная концентрация 1,42%) и инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут. Используйте буфер для набухания с добавками (25 мМ Hepes, 1,5 мМ MgCl2, 10 мМ KCl и 0,1% NP-40) на льду в течение 10 минут, затем ресуспендируйте в буфере для иммунопреципитации, как описано (58). Затем образец подвергали ультразвуковой обработке в течение следующих циклов: 10 циклов (20 импульсов по 1 секунде) и статическое время 40 секунд. Инкубируйте антитела к иммуноглобулину G (Cell Signaling Technology; 1 мкл), гистону H3 (Cell Signaling Technology; 3 мкл), NFAT (Invitrogen; 3 мкл) и SP1 (Cell Signaling Technology; 3 мкл) с образцом при 4°C встряхивании в течение ночи. Образец инкубировали с шариками белка А (Thermo Fisher Scientific) при 4°C с осторожным перемешиванием в течение 1 часа, затем использовали шарики хелекс (Bio-Rad) для обогащения ДНК и протеиназу К (Thermo Fisher) для переваривания белка. Промотор TNFα определяли методом ПЦР: прямой праймер: GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; обратный праймер: GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (продукт 207 п.н.). Изображения получали с помощью Image Lab (Bio-Rad) и количественно анализировали с помощью программного обеспечения ImageJ.
Супернатант клеточной культуры собирали, как описано выше. Определение проводили в соответствии с инструкциями производителя наборов для ИФА человеческого TNFα (Invitrogen), человеческого IL-2 (Invitrogen) и человеческого IFN-γ (Abcam). Согласно протоколу производителя, супернатант разбавляли в соотношении 1:100 для определения TNFα и IL-2 и в соотношении 1:3 для определения IFN-γ. Для измерения абсорбции при 450 нм использовали многоканальный считыватель EnVision 2104 (PerkinElmer).
Клетки периферической крови (PBMC) были отделены от продуктов разделения лейкоцитов (STEMCELL Technologies) методом центрифугирования в градиенте плотности Ficoll. Клетки CD3+ были выделены из PBMC с использованием CD3-бусин (Miltenyi). В присутствии или отсутствии MNA клетки CD3+ активировали с помощью иммобилизованного на планшете CD3 (5 мкг/мл), растворимого CD28 (3 мкг/мл) и IL-2 (300 Ед/мл; Proleukin) в течение 3 дней. Через 3 дня клетки собирали, промывали 0,9% физиологическим раствором, а осадок быстро замораживали. Подсчет клеток проводили методом проточной цитометрии (Cytek Aurora; конфигурация 3L-16V-14B-8R) с использованием 123count eBeads.
Извлечение метаболитов, как описано выше. Высушенный экстракт был восстановлен до концентрации 4000 клеточных эквивалентов/мкл. Анализ образца проводился методом обращенно-фазовой хроматографии (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния) с использованием колонки CORTECS T3 (2,1×150 мм, размер частиц 1,6 мкм, размер пор 120 Å; № 186008500, Waters). Масс-спектрометр Polar (6470, Agilent), в котором электрораспылительная ионизация работает в положительном режиме. Подвижная фаза А — 0,1% муравьиная кислота (в H2O), подвижная фаза В — 90% ацетонитрил, 0,1% муравьиная кислота. Градиент жидкостной хроматографии составляет от 0 до 2 минут для 100% A, от 2 до 7,1 минут для 99% B и от 7,1 до 8 минут для 99% B. Затем колонку реэквилибрируют подвижной фазой A со скоростью потока 0,6 мл/мин в течение 3 минут. Скорость потока составляет 0,4 мл/мин, а камера колонки нагревается до 50°C. Используйте чистый химический стандарт MNA (M320995, Toronto Research Chemical Company, Норт-Йорк, Онтарио, Канада) для определения времени удерживания (RT) и превращения (RT = 0,882 минуты, превращение 1 = 137→94,1, превращение 2 = 137→92, превращение 3 = 137→78). Когда все три перехода происходят при правильном времени удерживания, для количественного определения используется переход 1 для обеспечения специфичности. Стандартная калибровочная кривая MNA (Toronto Research Chemical Company) была построена путем шести последовательных разведений исходного раствора (1 мг/мл) для получения стандартов с концентрациями 0,1, 1,0, 10 и 100 нг/мл и 1,0 и 10 мкг/мл соответственно. Предел обнаружения составляет 1 нг/мл, а линейная зависимость находится в диапазоне от 10 нг/мл до 10 мкг/мл. Для анализа методом ЖХ/МС использовалась каждая инъекция двух микролитров образца и стандарта, а для обеспечения стабильности аналитической платформы каждые восемь инъекций проводился анализ смешанного контрольного образца. Реакции MNA всех образцов клеток, обработанных MNA, находились в линейном диапазоне анализа. Анализ данных проводился с использованием программного обеспечения для количественного анализа MassHunter (версия 9.0, Agilent).
Конструкция αFR-CAR второго поколения была взята из работы Song et al. (59). Вкратце, конструкция содержит следующее: лидерную последовательность CD8a, специфический для человеческого αFR одноцепочечный вариабельный фрагмент, шарнирную и трансмембранную области CD8a, внутриклеточный домен CD27 и внутриклеточный домен CD3z. Полная последовательность CAR была синтезирована компанией GenScript, а затем клонирована в лентивирусный экспрессионный вектор второго поколения перед кассетой экспрессии GFP, используемой для оценки эффективности трансдукции.
Лентивирус получают путем трансфекции клеток HEK293T [Американская коллекция типовых культур (ATCC)], выращенных в модифицированной среде Дульбекко, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина-стрептомицина (PenStrep), с использованием вектора CAR-GFP и упаковочных плазмид (psPAX2 и pMD2.G, Addgene) с применением липофекции амином (Sigma-Aldrich). Супернатант, содержащий вирус, собирали через 48 и 72 часа после трансфекции, фильтровали и концентрировали методом ультрацентрифугирования. Концентрированный вирусный супернатант хранили при -80°C до трансдукции.
Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) отделяют от продуктов разделения лейкоцитов здоровых доноров (STEMCELL Technologies) методом центрифугирования в градиенте плотности Ficoll. Для выделения клеток CD8+ из PBMC используют микрочастицы CD8 для позитивной селекции (Miltenyi). Т-клетки стимулируют с помощью TransAct (Miltenyi) в среде TexMACS [Miltenyi; с добавлением 3% инактивированной нагреванием сыворотки человека, 1% пенициллина-стрептомицина и ИЛ-2 (300 Ед/мл)]. Через 24 часа после стимуляции Т-клетки трансдуцируют лентивирусом (10 мкл концентрированного вирусного супернатанта на 10⁶ клеток). Через 1–3 дня после трансдукции на Cytek Aurora (на FSC (прямое рассеяние)/SSC (боковое рассеяние), синглет, GFP+) оценивают экспрессию GFP в клетках, чтобы продемонстрировать эффективность трансдукции не менее 30%.
CAR-T-клетки культивировали в течение 24 часов в среде Immunocult (STEMCELL Technologies; с добавлением 1% пенициллина-стрептомицина) в следующих условиях: без обработки, с обработкой 250 мкМ аденозина или 10 мМ MNA. После предварительной обработки CAR-T-клетки промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) и смешивали с 20 000 клетками SK-OV-3 [ATCC; в среде McCoy 5A (Sigma-Aldrich) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина-стрептомицина в соотношении 10:1. Соотношение эффекторных клеток к клеткам-мишеням, равное 1, измеряли в трех повторах в среде Immunocult с добавлением пенициллина-стрептомицина. В качестве отрицательного и положительного контроля использовали клетки SK-OV-3 и клетки SK-OV-3, лизированные сапонином дигиталиса (0,5 мг/мл; Sigma-Aldrich) соответственно. После 24 часов совместного культивирования супернатант собирали, и активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ) измеряли в соответствии с инструкциями производителя (набор для определения цитотоксичности LDH Glo, Promega). Супернатант ЛДГ разбавляли в соотношении 1:50 в буфере для ЛДГ. Процент уничтожения клеток измеряли по следующей формуле: процент уничтожения = процент коррекции / максимальная скорость уничтожения x 100%, где процент коррекции = совместное культивирование только Т-клеток, а максимальная скорость уничтожения = положительный контроль - отрицательный контроль.
Как описано в тексте или в разделе «Материалы и методы», для статистического анализа используйте GraphPad Prism 8, Microsoft Excel или R версии 3.6.0. Если от одного и того же пациента взято несколько образцов (например, асцитическая жидкость и опухоль), мы используем парный t-тест или включаем пациента в качестве случайного эффекта в линейную или обобщенную модель в зависимости от ситуации. Для метаболомного анализа тест на значимость проводится в трех повторениях.
Дополнительные материалы к этой статье можно найти по адресу http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution-Non-Commercial, которая разрешает использование, распространение и воспроизведение в любом формате при условии, что конечное использование не преследует коммерческой выгоды и что оригинальная работа является корректной. Ссылка.
Примечание: Мы просим вас указать адрес электронной почты только для того, чтобы человек, которого вы рекомендуете этой странице, знал, что вы хотите, чтобы он увидел это письмо, и что это не спам. Мы не будем собирать адреса электронной почты.
Этот вопрос используется для проверки того, являетесь ли вы посетителем, и предотвращения автоматической отправки спама.
Мариса К. Килгур (Мариса К. Килгур), Сара Макферсон (Сара Макферсон), Лорен Дж. Захариас (Лорен Дж. Захариас), Эбигейл Эли Арис Дж. Уотсон (Х. Уотсон), Джон Стэгг (Джон Стэгг), Брэд Х. Нельсон (Брэд Х. Нельсон), Ральф Дж. Де Беллардини (Ральф Дж. ДеБерардинис), Рассел Дж. Джонс (Рассел Дж. Джонс), Финеас Т. Гамильтон (Phineas T.
MNA способствует подавлению иммунитета Т-клеток и представляет собой потенциальную мишень для иммунотерапии при лечении рака у человека.
Мариса К. Килгур (Мариса К. Килгур), Сара Макферсон (Сара Макферсон), Лорен Дж. Захариас (Лорен Дж. Захариас), Эбигейл Эли Арис Дж. Уотсон (Х. Уотсон), Джон Стэгг (Джон Стэгг), Брэд Х. Нельсон (Брэд Х. Нельсон), Ральф Дж. Де Беллардини (Ральф Дж. ДеБерардинис), Рассел Дж. Джонс (Рассел Дж. Джонс), Финеас Т. Гамильтон (Phineas T.
MNA способствует подавлению иммунитета Т-клеток и представляет собой потенциальную мишень для иммунотерапии при лечении рака у человека.
©2021 Американская ассоциация содействия развитию науки. все права защищены. AAAS является партнером HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef и COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.